血漿Exosomes生物學(xué)特征及血漿Exosomes對巨噬細(xì)胞功能影響的初步研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文血漿Exosomes生物學(xué)特征及血漿Exosomes對巨噬細(xì)胞功能影響的初步研究姓名:李丹專業(yè):臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)導(dǎo)師:范華弊研究員指導(dǎo)小組成員:楊潔任亞娜楊贅銘二O一一年五月復(fù)旦大學(xué)碩l學(xué)位論文中文摘要目的1.研究人血漿Exosomes小體的生物學(xué)特征，了解血漿Exosomes在免疫系統(tǒng)中的作用。2.通過將人血漿Exosomes小體與體外誘導(dǎo)分化獲得的人Ml巨噬細(xì)胞共孵育，研究巨噬細(xì)胞的Wntsa通路是否被血漿Ex

2、osomeS小體激活。方法:1.采用超速離心和超濾的方法分離純化血漿外泌體樣小體，從而獲得無菌的血漿外泌體樣小體。用透射電鏡觀察血漿Exosomes形態(tài)流式檢測血漿ExosomeS分子表型Westernblot檢測血漿Exosomes的蛋白。2.從健康人的外周血中分離PBMCS，然后體外培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得I型巨噬細(xì)胞。通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及流式檢測細(xì)胞表面分子確定培養(yǎng)細(xì)胞是否為巨噬細(xì)胞。將血漿外泌體樣小體與I型巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)后，提取巨噬細(xì)

3、胞的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增及電泳比較未受血漿外泌體樣小體刺激的巨噬細(xì)胞及受刺激的巨噬細(xì)胞的炎性因子基因的變化，如:ILI日、IL6、TNFa、兒10。用流式檢測血漿外泌體樣小體處理巨噬細(xì)胞不同時間段胞內(nèi)CaZ‘的變化，其中以Wntsa刺激巨噬細(xì)胞胞內(nèi)Ca2的變化做陽性對照組。用WesternBlot方法檢測了血漿外泌體樣小體刺激的巨噬細(xì)胞CamKH是否發(fā)生了磷酸化。結(jié)果:1.從健康人血漿中超速離心獲得ExoSOmes。用透射電鏡觀察小體形

4、態(tài)，這些小體形態(tài)均一，為圓形囊泡結(jié)構(gòu)采用CD63抗體包被磁珠捕獲的血漿Exosomes樣小體的CD81的陽性率為73.68%，17.83%的血漿Exosomes樣小體表達(dá)CD86，HLA一DR陽性率為60.63%，血漿Exosomes樣小體還表達(dá)勃附相關(guān)的分子CD54和CD1IC，陽性率分別為14.66%和17.83%血漿Exosomes富含有CD63和CD81蛋白，而且通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)小體含有卜LA一DR、CDSO、CD86和Wntsa