棉鈴蟲Bt受體鈣粘蛋白的免疫組織化學(xué)及Cry1Ab毒素在氨肽酶N上的結(jié)合區(qū)定位.pdf

1、Bt毒素是防治農(nóng)業(yè)害蟲的重要的生物農(nóng)藥。當(dāng)利用轉(zhuǎn)Bt基因棉花進(jìn)行害蟲治理時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥已經(jīng)有很大程度的減少，同時(shí)某些昆蟲也出現(xiàn)了對(duì)Bt的抗性，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅。目前，Bt毒素的作用機(jī)理和抗性機(jī)制還不是很清楚。 CrylAb和CrylAc毒素都能結(jié)合棉鈴蟲中腸上皮細(xì)胞的鈣粘蛋白(Cadherin-like protein)和氨肽酶N(AminopeptidaseN，APN)，目前，CrylA毒素與中腸上受體的作用機(jī)制還不是很

2、清楚，為了進(jìn)一步了解毒素與中腸受體之間的相互作用，在本論文中，利用免疫組織化學(xué)的方法分析了鈣粘蛋白在中腸上皮細(xì)胞的組織水平上的定位，并比較了敏感品系和抗性品系的棉鈴蟲中腸上皮鈣粘蛋白的免疫定位。此外，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)的不同長(zhǎng)度的氨肽酶N片段，利用Western blot技術(shù)來(lái)確定CrylAb毒素在結(jié)合區(qū)的定位。利用高碘酸氧化的方法確定氨肽酶N的糖基化對(duì)其與CrylAb和CrylAc毒素結(jié)合的影響。 主要結(jié)果如下：鈣粘蛋白是位于中

3、腸上皮細(xì)胞的微絨毛的頂部，并且在整個(gè)中腸均勻分布，在中腸上皮的底膜也有分布。此外，在細(xì)胞質(zhì)中有微弱的染色，這表明鈣粘蛋白在細(xì)胞質(zhì)的反面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成后，向微絨毛的頂端動(dòng)態(tài)運(yùn)輸。從棉鈴蟲敏感品系和抗性品系的免疫組織定位來(lái)看，鈣粘蛋白的免疫定位并沒(méi)有顯著的變化。這種分布模式也表明，毒素必須穿過(guò)圍食膜，然后才與鈣粘蛋白結(jié)合。同時(shí)也表明鈣粘蛋白的這種分布模式與Bt毒素的作用機(jī)制是一致的。不同長(zhǎng)度的原核表達(dá)重組氨肽酶N片段與CrylAb毒素雜交表明

4、，至少存在有2個(gè)結(jié)合區(qū)，其中的一個(gè)結(jié)合區(qū)位于1 Met——329 Leu，而另一個(gè)結(jié)合區(qū)位于396 Val——517 Ala。通過(guò)分析APN氨基酸序列發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)結(jié)合區(qū)都不包含“鋅結(jié)合位點(diǎn)<'375>ILSHEIAHMW<'384>”，這表明毒素結(jié)合APN是不依賴這種“鋅結(jié)合位點(diǎn)”結(jié)構(gòu)。大豆凝集素SBA雜交與配基雜交實(shí)驗(yàn)表明，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)共價(jià)偶聯(lián)在120 kDa的APN上，高碘酸氧化處理雜交膜實(shí)驗(yàn)表明，GaINAc是C