豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查及其GP5蛋白單克隆抗體制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬套式病毒目(Nidovirales)，動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae），動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus）。豬高致病性藍(lán)耳病(Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrom

2、e，HP-PRRS)是PRRSV引起的嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的一種RNA病毒性傳染性疾病，以導(dǎo)致呼吸道疾病和母豬繁殖障礙為主。中國(guó)2006年4月南方地區(qū)暴發(fā)了豬高致病性藍(lán)耳病，主要表現(xiàn)持續(xù)高熱、食欲廢絕、藍(lán)耳、身體發(fā)紺、腹瀉等臨床癥狀，發(fā)病率和死亡率都非常高，傳播速度快，迅速波及全國(guó)大部分省份，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。
　　2013年以來(lái)，全國(guó)各地豬場(chǎng)先后發(fā)現(xiàn)重組毒株。為了了解豬藍(lán)耳病在浙江及周邊地區(qū)的流行情況，本研究采集2013-2015年期

3、間浙江、河南、四川、江西、甘肅、安徽、廣東、福建、湖南和上海10省市發(fā)病豬場(chǎng)的205份病料，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，病料PRRSV的陽(yáng)性率為33.2％(68/205)，對(duì)其中21個(gè)陽(yáng)性病料中PRRSV GP5基因、Nsp2基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，將測(cè)得的序列和本實(shí)驗(yàn)室2006-2008年測(cè)得的9條GP5序列、9條Nsp2序列一起進(jìn)行分析，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明:所分析的毒株序列中，23株處于JXA1類似的亞型群，有1株SX071226屬于美洲經(jīng)典毒株VR

4、2332亞群，另外HZL1501，ZJXS1501，ZJXS1412，ZJSX1503，XS070425，SH061130這6個(gè)毒株處于中間過(guò)渡態(tài)群里。JXA1-like群又可以分為兩支，其中一支與JXA1親緣關(guān)系較近，主要是2014-2015年的毒株，另外一支與JXA1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，主要是2006-2008年的毒株。本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自四川、上海、江西、福建、浙江、甘肅、安徽和廣東8個(gè)省的豬場(chǎng)主要流行這3種類型的毒株，而且以JXA1為代表的

5、HP-PRRSV仍然是優(yōu)勢(shì)毒株，其次是中間過(guò)渡群毒株。重組分析表明，中間過(guò)渡態(tài)群里的HZL1501是由JXA1，NADC30，GM2這三株毒重組而來(lái)。在本研究中也首次發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)JNA1502Nsp2的481-485aa缺失，之前尚未有報(bào)道，HZL1501Nsp2的15-24aa的缺失也是第一次發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明，目前流行于上述省市的PRRSV毒株發(fā)生了新的變異。
　　以原核表達(dá)的PRRSV GP5截短蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠制

6、備抗GP5蛋白的單克隆抗體。利用細(xì)胞融合技術(shù)和有限稀釋方法得到了4株穩(wěn)定分泌抗GP5蛋白抗體的單克隆細(xì)胞1D1、1D2、2E1和2H7，間接免疫熒光和Western blot檢測(cè)顯示，鼠抗GP5蛋白的4株單抗能與PRRSV野毒株感染的細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)。亞型鑒定2H7的重鏈為IgG2a，2E1的重鏈為IgG2b，1D1和1D2的重鏈為IgG1，四株單抗輕鏈均為κ鏈。
　　用Marc145細(xì)胞培養(yǎng)病毒的方法從臨床病料中分離到一株疑似