馬尾神經(jīng)損害發(fā)病機(jī)制的初步研究.pdf

1、隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，人們對(duì)疾病認(rèn)識(shí)程度的加深，馬尾神經(jīng)損害(Cauda EquinaLesion，CEC)及由此導(dǎo)致的馬尾神經(jīng)綜合征(Cauda equina syndrome，CES)愈來(lái)愈引起學(xué)者們的重視。據(jù)統(tǒng)計(jì)，普通人群中CES的發(fā)病率為1：100，000到1：33，000之間，患有下腰痛的人群中CES發(fā)病率為萬(wàn)分之4，而在患有腰椎間盤突出的患者中，CES發(fā)病率更是達(dá)到了1％～10％。我國(guó)近30％的腰椎疾患的患者存在不同程度的CEC癥

2、狀。馬尾神經(jīng)損害及其繼發(fā)性病理生理反應(yīng)可直接導(dǎo)致組織器官神經(jīng)功能損傷及功能障礙，導(dǎo)致下肢疼痛、運(yùn)動(dòng)感覺功能、大小便功能及性功能障礙，且其治療困難，致殘率非常高，給患者本人造成了極大的痛苦，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前對(duì)CEC的研究相對(duì)較少而且緩慢，預(yù)后難以預(yù)料，主要是該病的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，對(duì)此認(rèn)識(shí)還不夠全面、深入。以往研究顯示，馬尾神經(jīng)損害致神經(jīng)元的凋亡是造成馬尾神經(jīng)壓迫臨床癥狀的重要原因，但究竟是哪些基因參與了馬尾神經(jīng)損害

3、導(dǎo)致的神經(jīng)元的凋亡尚不清楚。國(guó)內(nèi)外近年研究顯示，馬尾神經(jīng)壓迫損傷后，其局部病理改變?nèi)绮荒艿玫郊皶r(shí)改善，則形成惡性循環(huán)，由馬尾神經(jīng)的局部損害到廣泛性病理?yè)p害，可產(chǎn)生順行性、逆行性變性及傳遞性神經(jīng)元變性，以至于產(chǎn)生跨細(xì)胞的中樞神經(jīng)元變性，而致使其結(jié)構(gòu)和功能難以修復(fù)，造成永久性的功能損害。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本課題擬通過建立實(shí)驗(yàn)性大鼠馬尾神經(jīng)壓迫模型，就馬尾神經(jīng)損害的基礎(chǔ)進(jìn)行初步探討。 第一部分：馬尾神經(jīng)壓迫動(dòng)物模型的建立及馬尾神經(jīng)壓迫電

4、生理的實(shí)驗(yàn)研究 目的：對(duì)SD大鼠腰椎區(qū)域相關(guān)組織解剖行初步觀測(cè)，建立合適的馬尾神經(jīng)損害動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫后行為學(xué)、神經(jīng)電生理及組織學(xué)研究。 方法：首先對(duì)SD大鼠腰椎區(qū)域相關(guān)組織解剖做了初步觀測(cè)，得到SD大鼠腰椎區(qū)域相關(guān)解剖數(shù)據(jù)，根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)制作改良的實(shí)驗(yàn)性大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫動(dòng)物模型。之后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為以下4組：CON組：空白對(duì)照組(n=8)；SHAM組：假手術(shù)組(n=8)；CCC組

5、：經(jīng)典馬尾神經(jīng)壓迫組(n=8)；MCC組：改良馬尾神經(jīng)壓迫組(n=9)。手術(shù)建立改良的實(shí)驗(yàn)性大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫動(dòng)物模型：顯露L4～L5的椎板，擴(kuò)大L4/5椎間隙，切除L4/5間隙的黃韌帶，向尾端塞入10.0×1.0×(1.1-1.3)mm硅膠條1根。并與經(jīng)典實(shí)驗(yàn)性大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫動(dòng)物模型進(jìn)行比較。術(shù)后第1、3、7、14、28天對(duì)此模型進(jìn)行了行為學(xué)評(píng)價(jià)，包括：BBB評(píng)分、電子von Frey機(jī)械測(cè)痛法測(cè)定大鼠縮足潛伏期、熱板實(shí)驗(yàn)、甩

6、尾實(shí)驗(yàn)、步行分析。結(jié)合HE染色及尼氏染色，光鏡下對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫模型進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上，使用誘發(fā)電位記錄儀，進(jìn)行了脊髓誘發(fā)電位(SCEP)N1波潛伏期及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)的動(dòng)態(tài)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)性大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫后電生理的動(dòng)態(tài)變化。 結(jié)果：模型制作大鼠死亡率低。步行分析強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)評(píng)價(jià)顯示，模型組大鼠術(shù)后出現(xiàn)明顯神經(jīng)源性間歇性跛行，并且持續(xù)穩(wěn)定，CON組與SHAM相比無(wú)明顯差異；CCC組及MCC組相

7、比無(wú)明顯差異。BBB評(píng)分顯示，與對(duì)照組相比，模型組術(shù)后靜態(tài)運(yùn)動(dòng)功能減退不明顯，非強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)功能術(shù)后恢復(fù)較早；相關(guān)感覺行為指標(biāo)評(píng)價(jià)出現(xiàn)了明顯感覺障礙，主要表現(xiàn)為痛覺及熱覺減退，以術(shù)后早期明顯，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，感覺功能逐漸恢復(fù)，但未恢復(fù)到術(shù)前水平。通過對(duì)壓迫DRG(DRG)、馬尾神經(jīng)(CE)及脊髓、圓錐的大體觀、組織病理學(xué)的動(dòng)態(tài)觀察，可見神經(jīng)根壓迫后其有髓神經(jīng)纖維數(shù)目減少和組織結(jié)構(gòu)的改變，如神經(jīng)膜細(xì)胞胞質(zhì)腫脹和細(xì)胞水腫、尼氏體減少、華勒變性、神

8、經(jīng)元軸突脫髓鞘變等。電生理研究發(fā)現(xiàn)，馬尾神經(jīng)受壓后SCEP發(fā)生的變化明顯，潛伏期明顯延長(zhǎng)，至術(shù)后14天仍不能完全恢復(fù)；MNCV的下降恢復(fù)較快，術(shù)后7天即恢復(fù)到術(shù)前水平。 結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，改良的實(shí)驗(yàn)性大鼠急性馬尾神經(jīng)壓迫模型可以復(fù)制出神經(jīng)源性間歇性跛行，且更接近于椎管狹窄對(duì)馬尾神經(jīng)的壓迫，為臨床馬尾神經(jīng)壓迫導(dǎo)致的疼痛及麻木治療的研究建立了可供參考的動(dòng)物模型。行為學(xué)評(píng)價(jià)說明，馬尾神經(jīng)壓迫性損傷后，出現(xiàn)感覺功能障礙，且隨著時(shí)

9、間延長(zhǎng)，神經(jīng)功能有所恢復(fù)，但由于壓迫因素未解除，神經(jīng)功能不能恢復(fù)到術(shù)前水平。電生理實(shí)驗(yàn)研究說明馬尾神經(jīng)感覺支對(duì)機(jī)械壓迫的反應(yīng)比較敏感，而運(yùn)動(dòng)支相對(duì)則較容易恢復(fù)。 第二部分：馬尾神經(jīng)壓迫后DRG、馬尾神經(jīng)與相應(yīng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡及PUMA的表達(dá) 目的：研究馬尾神經(jīng)壓迫后DRG、馬尾神經(jīng)與相應(yīng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞有無(wú)凋亡的發(fā)生：了解馬尾神經(jīng)壓迫后是否導(dǎo)致PUMA表達(dá)的變化以及表達(dá)數(shù)量隨時(shí)間的變化，為手術(shù)時(shí)機(jī)的選擇提供依據(jù)，以及為手術(shù)的

10、療效提供評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 方法：將50只SD大鼠隨機(jī)分為下列幾組：A組：空白對(duì)照組(n=10)；B組：馬尾神經(jīng)壓迫1d組(n=8)；C組：馬尾神經(jīng)壓迫3d組(n=8)；D組：馬尾神經(jīng)壓迫7d組(n=8)；E組：馬尾神經(jīng)壓迫14d組(n=8)；F組：馬尾神經(jīng)壓迫28d組(n=8)。 用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)DRG、馬尾神經(jīng)與相應(yīng)脊髓中PUMA的表達(dá)。具體如下：4％的多聚甲醛灌注固定大鼠，取出標(biāo)本，經(jīng)石蠟包埋后切片，厚度在4μm。

11、二甲苯脫蠟后，經(jīng)梯度乙醇至水和TBS沖洗，用3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化酶約5分鐘，加入0.01M檸檬酸緩沖液(pH6.0)，煮沸20分鐘，再用5-10％山羊血清室溫封閉20分鐘。一抗孵育1h小時(shí)和二抗孵育30分鐘后，用DAB顯色處理，最后經(jīng)TBS沖洗，蘇木素復(fù)染和二甲苯透明后，用中性樹膠封片。 用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(Tunel)法檢測(cè)DRG、馬尾神經(jīng)與相應(yīng)脊髓中細(xì)胞凋亡：4μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3％過氧化

12、氫封閉，蛋白酶K處理后置入Tunel混合液，37℃，1h，Streptavidin-HRP30min后，0.04％DAB+0.03％H2O2顯色10min，蘇木素襯染和二甲苯透明后，常規(guī)樹脂封片。 采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)DRG、馬尾神經(jīng)與相應(yīng)脊髓中PUMA基因mRNA的表達(dá)水平：TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA，RNA的鑒定及定量，逆轉(zhuǎn)錄至cDNA，引物設(shè)計(jì)與合成，BLAST確認(rèn)引物特異性，測(cè)定各樣品的Ct值，以β-actin

13、濃度為參照對(duì)待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行校正。 結(jié)果：免疫組化結(jié)果示對(duì)照組未見明顯PUMA陽(yáng)性深染區(qū)。當(dāng)大鼠馬尾神經(jīng)壓迫后，相應(yīng)脊髓神經(jīng)元胞體可見大量陽(yáng)性深染區(qū)，主要集中在腹角及背角。Tunel染色示大鼠馬尾神經(jīng)壓迫術(shù)后，在相應(yīng)脊髓節(jié)段發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元凋亡，以脊髓前背角明顯，與對(duì)照組相比，P＜0.05；而各組DRG及馬尾神經(jīng)凋亡細(xì)胞少見，與對(duì)照組比較，P＞0.05。術(shù)前DRG、馬尾神經(jīng)與脊髓中PUMA基因mRNA的表達(dá)水平，組間比較，P＞0.

14、05；術(shù)后相應(yīng)脊髓中PUMA基因mRNA的表達(dá)水平隨時(shí)間出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，術(shù)后第3天出現(xiàn)顯著的PUMA增量調(diào)節(jié)，結(jié)果與術(shù)前相比，P＜0.05；DRG、馬尾神經(jīng)中PUMA基因mRNA的表達(dá)水平變化與術(shù)前相比無(wú)明顯變化，P＞0.05。 結(jié)論：大鼠馬尾神經(jīng)壓迫術(shù)后，可導(dǎo)致逆行性脊髓、背根節(jié)及馬尾神經(jīng)出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡。馬尾神經(jīng)受壓后可在相應(yīng)脊髓部位出現(xiàn)顯著的PUMA增量調(diào)節(jié)。 第三部分：大鼠馬尾神經(jīng)損害致逆行性脊髓損害的初步研究

15、 目的：在蛋白水平檢測(cè)大鼠馬尾神經(jīng)壓迫逆行性導(dǎo)致相應(yīng)脊髓神經(jīng)元凋亡作用中的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討PUMA這一凋亡通路中的重要因子在馬尾神經(jīng)壓迫中的作用，以及PUMA、p53、SirT2間的相互作用機(jī)制。 方法：用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)DRG、馬尾神經(jīng)與脊髓中p53、SirT2的表達(dá)。具體方法同上一部分。用Western-Blot方法檢測(cè)脊髓中PUMA、p53、SirT2的表達(dá)：取100mg組織加入0.2ml裂解液進(jìn)行勻漿提取

16、蛋白，將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后，加入上樣緩沖液進(jìn)行電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉和孵育一抗、二抗后鑒定。 結(jié)果：p53免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示：正常對(duì)照組少見明顯陽(yáng)性深染區(qū)。當(dāng)大鼠馬尾神經(jīng)壓迫后，相應(yīng)脊髓神經(jīng)元胞體可見大量陽(yáng)性深染區(qū)。SirT2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示：A組在脊髓前背角可見陽(yáng)性深染區(qū)。馬尾神經(jīng)受壓迫后，脊髓內(nèi)神經(jīng)元胞體陽(yáng)性深染區(qū)減少，顏色減淡，術(shù)后各組間差別不明顯。馬尾神經(jīng)及DRG壓迫前后未發(fā)現(xiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)。Western b