RNAi技術(shù)干擾骨肉瘤細(xì)胞Dll4表達(dá)抑制侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討D114在骨肉瘤組織的表達(dá)及意義；靶向沉默D114的表達(dá)對骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的作用機(jī)制。 方法： (1)采用免疫組化的方法檢測62例骨肉瘤組織中D114蛋白的表達(dá)，結(jié)合臨床病理資料分析，研究D114的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。 (2)構(gòu)建全長的逆轉(zhuǎn)錄病毒pSUPER- D114-siRNA質(zhì)粒，通過鑒定后，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到PT67細(xì)胞培養(yǎng)，獲得分泌D114蛋白病毒血清，干預(yù)沉默入骨肉瘤細(xì)胞株SOSP

2、-9607E10中D114的表達(dá)；干預(yù)沉默人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HMEC-1)，體外采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、血管成管實(shí)驗(yàn)、MTT和流式細(xì)胞儀檢測等方法，研究D114調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞分化增殖、骨肉瘤侵襲運(yùn)動和骨肉瘤血管成管的分子機(jī)制驗(yàn)證D114調(diào)控骨肉瘤血管成管的分子機(jī)制導(dǎo)致腫瘤生物學(xué)行為的改變。 結(jié)果： (1) Notcb1、D114在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達(dá)Notchl蛋白的陽性表達(dá)主要在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)

3、或細(xì)胞膜，呈棕黃色，散在分布。62例骨肉瘤中有53例呈陽性表達(dá)，陽性率為85.5％(53/62)，對照組為21.2％(9/43)，兩組差異具有顯著性(P<0.05)。D114蛋白的陽性表達(dá)主要在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，部分表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞。62例骨肉瘤中有55例呈陽性表達(dá)，陽性率為88.7％(54/62)，對照組為23.6％(10/43)，兩者之間差別具有顯著性(P<0.05)，Notch1和D114在骨肉瘤中的表達(dá)高于在骨軟骨瘤中

4、的表達(dá)，提示Notch1和D114可能參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。 (2).Notch1、D114表達(dá)及其與骨肉瘤病理臨床指標(biāo)的關(guān)系 Notchl與D114在骨肉瘤中表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)rs為0.842，P-0.027。Notch1及D114蛋白表達(dá)與骨肉瘤組織分化程度、Ennecking分期和有無轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，但與腫瘤直徑、性別、年齡、ALP(堿性磷酸酶)無關(guān)(P>0.05)。 (3)骨

5、肉瘤中Notch1和D114表達(dá)與MVD表達(dá)的關(guān)系 Notch1高表達(dá)組MVD為35.2±9.3，顯著高于低表達(dá)組28.3±3.4，此外，D114高表達(dá)組MVD為36.2±7.2，顯著高于低表達(dá)組29.5±2.2，差別具有顯著性(P<0.05)。骨肉瘤中Notch1和D114表達(dá)與MVD表達(dá)的具有相關(guān)性(P<0.05)，Notchl及D114蛋白高表達(dá)可能在骨肉瘤血管生成進(jìn)程中起重要作用。 (4) D114的表達(dá)與骨肉

6、瘤的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān) D114 mRNA和蛋白在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10兩株細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示：在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10兩個(gè)骨肉瘤細(xì)胞株細(xì)胞中，D114 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別0.43±0.11 vs0.86±0.09、0.47±0.05vs0.82±0.08，具有顯著性差異(P<0.05)。 (5)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小RNA干擾特異性沉默SOSP-9607E

7、IO癌細(xì)胞系中D114的表達(dá) SOSP-9607E10D114RNAi+中D114的表達(dá)被明顯抑制，較對照組而言，其抑制效率超過70％(P<0.05)，而作為對照的SOSP-9607E10D114RNAi-中D114的表達(dá)較SOSP-9607E10細(xì)胞系無明顯變化。以上結(jié)果提示本研究中采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小RNA干擾能夠有效特異的沉默SOSP-9607E10骨肉瘤細(xì)胞中D114的表達(dá)。 (6)體外實(shí)驗(yàn)中抑制D114的表

8、達(dá)可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲遷移而不影響其增殖和凋亡 SOSP-9607E10D114RNAi+較SOSP-9607ElOD114RNAi-細(xì)胞遷移能力明顯下降，24小時(shí)劃痕愈合率分別為62％vs77％，差異具有顯著性意義(P<0.05)。采用Transwell侵襲小室測定法比較SOSP-9607E10D114RNAi+和SOSP-9607E10D114RNAi-的侵襲能力，結(jié)果顯示SOSP-9607E10D114RNAi+和S

9、OSP-9±607E10D114RNAi-細(xì)胞侵襲能力明顯下降，24小時(shí)培養(yǎng)后穿過Transwell的每低倍視野細(xì)胞數(shù)分別為63±11' vs129±13，差異具有顯著性意義(P<0.05)。用MTT法比較SOSP-9607E10D114RNAi+和SOSP-9607E10D114RNAi-的增殖能力，差異不具有顯著性意義(P>0.05)。檢測SOSP-9607E10D114RNAi+和SOSP-9607E10D114RNAi-的凋亡情

10、況，兩組細(xì)胞差異不具有顯著性意義(P>0.05)。 (7)體內(nèi)抑制D114的表達(dá)可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的成瘤能力 比較MiceD114RNAi+和Mice D114RNAi-兩組裸鼠模型中SOSP-9607E10原發(fā)瘤的大小，結(jié)果顯示皮下種植45天后SOSP-9607E10原發(fā)瘤的大小(cm3)分別為3.010.22和3.45±0.23，差異具有顯著性意義(P<0.05)，比較MiceD114RNAi+和MiceD114RN

11、Ai-兩組裸鼠模型SOSP-9607E10原發(fā)瘤中的MVD，結(jié)果顯示MiceD114RNAi+和Mice D114RNAi-兩組裸鼠模型SOSP-9607E10原發(fā)瘤中每高倍鏡視野平均MVD值分別為29±2和37±3，差異具有顯著性意義(P<0.05)。 (8)體外實(shí)驗(yàn)中抑制D114的表達(dá)可以抑制HMEC-1人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲遷移而不影響其增殖和凋亡 實(shí)驗(yàn)組HMEC-1D114RNAi+較對照組HMEC-1D114R

12、NAi-細(xì)胞遷移能力明顯下降，24小時(shí)劃痕愈合率分別為69％ vs92％，差異具有顯著性意義(P<0.05)。細(xì)胞侵襲能力也明顯下降，24小時(shí)培養(yǎng)后穿過Transwell的每低倍視野細(xì)胞數(shù)分別為49±6 vs70±3，差異具有顯著性意義(P<0.05)。MTT法比較HMEC-1D114RNAi+較對照組HMEC-1D114RNAi-的增殖能力，差異不具有顯著性意義(P>0.05)。兩組細(xì)胞的凋亡差異不具有顯著性意義(P>0.05)。

13、 (9)體外實(shí)驗(yàn)中抑制D114的表達(dá)可以抑制HMEC-1人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成 HMEC-1 D114RNAi+組不能成管；對照組成管指數(shù)為2397±726，實(shí)驗(yàn)組成管指數(shù)為489±215，兩組差異具有顯著性意義(P<0.05)。三維血管新生模型對照組和實(shí)驗(yàn)組中每10個(gè)微載體成管數(shù)分別為45±9和9±7，差異具有顯著性意義(P<0.05)，這些結(jié)果說明體外抑制D114的表達(dá)可以抑制HMEC-1人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成

14、。 (10)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑制D114的表達(dá)可以抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成 實(shí)驗(yàn)組Matrigel中的新生血管少于對照組，實(shí)驗(yàn)組和對照組Matrigel中新生血管總長度分別為23634±6421μm和32145±4314μm，差異具有顯著性意義(P<0.05)這說明體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑制的D114表達(dá)可以抑制VEGF誘導(dǎo)的新生血管生成。 結(jié)論：D114在骨肉瘤中的高表達(dá)可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，D114可能作為預(yù)測骨肉瘤不