結(jié)核分枝桿菌Rv1884c和Rv0867c基因的克隆表達(dá)及其促生長(zhǎng)作用的研究.pdf

1、結(jié)核?。═uberculosis，TB）為全球性傳染病，呈逐年增高趨勢(shì)，給人類帶來(lái)極大的危害，人們稱之為白色瘟疫。近二十余年來(lái)，人類免疫缺陷病毒（HIV）感染和艾滋病（AIDS）已席卷五大洲156 個(gè)國(guó)家。我國(guó)31 個(gè)省市區(qū)均有HIV/AIDS 報(bào)告，其蔓延勢(shì)頭令人震驚，HIV 陰性者感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB），一生中發(fā)生結(jié)核病的幾率占有10％左右，而HIV 陽(yáng)性者感染結(jié)核分枝桿菌后

2、一生中發(fā)生結(jié)核病的幾率增多至50％。結(jié)核分枝桿菌與HIV 雙重感染，無(wú)論HIV 感染在前或者結(jié)核分枝桿菌感染在前，雙重感染必然相互影響，相互促進(jìn)，加速了結(jié)核病和艾滋病的發(fā)生和發(fā)展，預(yù)后險(xiǎn)惡，病人短期內(nèi)死亡，造成結(jié)核病疫情呈現(xiàn)全球性的回升。WHO 報(bào)道，全球近三分之一的人已感染結(jié)核分枝桿菌，每年約有八百萬(wàn)新結(jié)核病人出現(xiàn)，死亡的人數(shù)達(dá)兩百萬(wàn)人。如果結(jié)核菌感染得不到有效控制的話，預(yù)計(jì)從2002 年到2020 年，又將有十億人感染結(jié)核菌。我國(guó)是

3、世界上22 個(gè)結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)居世界第二位，形勢(shì)更為嚴(yán)峻。 再加上90％結(jié)核菌感染者為隱匿感染，阻礙了結(jié)核病的診治。結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)，但是其生長(zhǎng)緩慢，如何使MTB 快速培養(yǎng)成為研究熱點(diǎn)之一。因此積極深入研究結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，找出更加有效的診斷、治療和預(yù)防結(jié)核病的新技術(shù)、新方法和新疫苗具有深遠(yuǎn)的意義。 復(fù)活促進(jìn)因子(resuscitation-promoting factor，Rpf)是

4、藤黃微球菌分泌的、可以在皮克水平以自分泌和旁分泌形式發(fā)揮促進(jìn)休眠期細(xì)菌復(fù)活的蛋白質(zhì)，為藤黃微球菌生長(zhǎng)所必需。同源分析檢索到結(jié)核分枝桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌和牛型結(jié)核分枝桿菌等富含GC的桿菌都具有與藤黃微球菌Rpf同源性很高的基因，且功能相似，類似真核生物的細(xì)胞因子，故被稱為細(xì)菌的細(xì)胞因子。結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因序列中Rv0867c（rpfA）、Rv1009（rpfB）、Rv1884c（rpfC）、Rv2389c（rpfD）

5、、Rv2450c（rpfE）均編碼類似于Rpf的蛋白，統(tǒng)稱為Rpf樣蛋白。它們具有很高的同源性，是約16KD的分泌蛋白，對(duì)刺激靜息期細(xì)菌的生長(zhǎng)起重要作用，因此推測(cè)對(duì)宿主體內(nèi)潛伏休眠的結(jié)核分枝桿菌的復(fù)活起促進(jìn)作用。分別敲除結(jié)核分枝桿菌基因組中的某一個(gè)Rpf基因時(shí)，其生長(zhǎng)并沒(méi)有受到明顯影響，說(shuō)明這一蛋白家族的功能有一定重疊，不是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)所必需的，但從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到停滯期它們的表達(dá)模式不同，在特定的感染期每個(gè)Rpf基因的功能也不相同。為

6、探討Rpf樣蛋白在其家族的生物功能及其對(duì)休眠期菌體的促生長(zhǎng)作用，本課題克隆表達(dá)了Rpf基因中的Rv1884c和Rv0867c兩個(gè)基因，并初步研究了其促生長(zhǎng)作用，為研究Rpf樣蛋白的其它功能打下基礎(chǔ)。 1、結(jié)核分枝桿菌Rv1884c 和Rv0867c 基因的克隆表達(dá)及蛋白的純化 根據(jù)GenBank 中結(jié)核分枝桿菌H37Rv 基因組核酸序列（登錄號(hào)：NC_000962）檢索出Rv1884c和Rv0867c基因的cDNA序列，

7、用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)含EcoRⅠ、BamHⅠ和HindIII酶切位點(diǎn)的特異性引物。以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，利用熱啟動(dòng)PCR方法分別擴(kuò)增出兩個(gè)目的基因片斷。將兩個(gè)片斷分別克隆入克隆載體pGEX-4T-1 和pUC19，酶切鑒定正確后，測(cè)序證實(shí)序列與GenBank中報(bào)告的完全一致，再分別克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1 和pPRO-EXHT，測(cè)序正確，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE證實(shí)成

8、功表達(dá)出了兩個(gè)融合蛋白。將誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌超聲裂解后，分別取上清、沉淀和菌體做SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在。隨后用GSTrap FF親和層析柱和Ni2+-NTA純化柱分別純化可溶性蛋白和包涵體形式的蛋白，并測(cè)定得到蛋白的濃度，Rv1884c蛋白的濃度為116.27μg.ml-1，Rv0867c蛋白的濃度為374.76μg.ml-1，保存于－20℃?zhèn)溆谩?2、Rv1884c 和Rv0867c

9、 蛋白促生長(zhǎng)作用的研究 分別培養(yǎng)藤黃微球菌、BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv，制成適當(dāng)濃度的菌懸液，然后分別加入五種不同濃度（0pM 、0.1pM 、1pM、10pM、100pM）的兩種蛋白，置37℃，取不同時(shí)間點(diǎn)的菌懸液測(cè)定OD600值，并分別繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，重組Rv1884c和Rv0867c蛋白對(duì)藤黃微球菌、BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv都有不同程度的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，經(jīng)上述重組蛋白作用后菌懸液的吸光度值OD600都高于對(duì)

10、照組菌懸液約0.4~1.3；兩種蛋白對(duì)BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv的促生長(zhǎng)作用比對(duì)藤黃微球菌的作用明顯；在相同條件下Rv0867c蛋白的促生長(zhǎng)作用總體強(qiáng)于Rv1884c蛋白。 本研究成功克隆了結(jié)核分枝桿菌Rv1884c和Rv0867c基因片斷，并在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，獲得了具有生物學(xué)活性的重組Rv1884c和Rv0867c蛋白；進(jìn)一步研究證實(shí)這兩種蛋白對(duì)藤黃微球菌、BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv均具有一定的促生長(zhǎng)作用，在相