RNAi沉默HDAC2基因?qū)?,25(OH)2D3調(diào)控肝癌HepG2細(xì)胞p21表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建組蛋白去乙?；?（HDAC2）基因的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA），并對(duì)其在肝癌細(xì)胞株HepG2中的干擾效率進(jìn)行鑒定。探討1,25(OH)2D3對(duì)HDAC2的抑制作用和抑癌基因p21WAFI/CIP1的表達(dá)情況，觀察1,25(OH)2D3是否通過抑制HDAC2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)p21WAFI/CIP1的高表達(dá)，從而調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞的增殖和分化。
　　方法:1、針對(duì)HDAC2 mRNA序列設(shè)

2、計(jì)3對(duì)RNA干擾靶序列及一條陰性對(duì)照序列，定向克隆至經(jīng)AgeI與EcoRI雙酶切線性化的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLKO.1-TRC cloning vector，構(gòu)建靶向抑制HDAC2基因表達(dá)真核表達(dá)載體pLKO.1-shRNA-HDAC2，酶切驗(yàn)證及測(cè)序鑒定。2、將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pLKO.1-shRNA-HDAC2采用脂質(zhì)體法共同轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T，包裝含HDAC2-shRNA的重組慢病毒顆粒。3、重組慢病毒顆粒感染HepG2細(xì)胞

3、，分別加入對(duì)應(yīng)重組慢病毒及對(duì)照慢病毒。分別采用Realtime PCR和Western blotting檢測(cè)HDAC2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，鑒定、分析重組質(zhì)粒的干擾效果。運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞增殖抑制率，觀察沉默HDAC2基因后對(duì)肝癌HepG細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。4、培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，經(jīng)慢病毒感染和/或1,25（OH）2D3處理，通過Realtime PCR和Western blotting檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)RNA

4、干擾和/或1,25（OH）2D3處理后HDAC2及p21WAFI/CIP1基因的mRNA水平和蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、shRNA退火連接克隆到慢病毒質(zhì)粒pLKO.1，經(jīng)酶切驗(yàn)證及測(cè)序鑒定表明篩選出的重組體測(cè)序結(jié)果與預(yù)期靶序列相同，pLKO.1–shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2、獲得有效濃度穩(wěn)定表達(dá)HDAC2的shRNA的重組慢病毒顆粒。3、Realtime PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，3

5、條干擾序列轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后均能明顯抑制HDAC2基因和蛋白表達(dá)（P<0.05）,其中以pLKO.1-HDAC2-shRNA1、3的干擾效果最明顯，兩者相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明HDAC2基因慢病毒干擾載體已成功構(gòu)建。4、CCK-8測(cè)定結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中的HDAC2蛋白表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制。5、1,25（OH）2D3處理HDAC2基因沉默后HepG細(xì)胞，與單獨(dú)沉默HDAC2基因組相比較，結(jié)果從mRN