FAT10功能域的活性分析.pdf

1、類(lèi)泛素蛋白家族是一類(lèi)結(jié)構(gòu)域與泛素有很高同源性的小分子量蛋白，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控起著多種重要作用。FAT10又被稱(chēng)為雙泛素，是類(lèi)泛素家族的成員之一。FAT10主要表達(dá)在胎盤(pán)、胸腺、脾、淋巴結(jié)，胚胎等與免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)的組織中。胃腸癌、肝癌、子宮癌、宮頸癌、卵巢癌等多種癌癥中，F(xiàn)AT10也存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。FAT10與抑癌基因p53關(guān)系密切，并參與細(xì)胞凋亡調(diào)控，研究表明FAT10以類(lèi)似泛素的方式與底物蛋白質(zhì)共價(jià)連接，并促進(jìn)其降解，但具體調(diào)控

2、機(jī)制尚不清楚。因此，對(duì)FAT10結(jié)構(gòu)與功能的活性研究，可以進(jìn)一步深入了解FAT10在細(xì)胞周期調(diào)控以及癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，為癌癥的臨床治療提供新的策略。
　　在本研究中，我們以人類(lèi)胸腺cDNA文庫(kù)為模板，成功擴(kuò)增了FAT10的全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框，并將其構(gòu)建到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCMV-HA中獲得pCMV-HA-FAT10重組質(zhì)粒。并進(jìn)一步構(gòu)建FAT10的N端及C端泛素結(jié)構(gòu)域，以及FAT10末端雙甘氨酸基團(tuán)突變的FAT10△GG于pC

3、MV-HA真核表達(dá)載體，成功表達(dá)出FAT10-HA，F(xiàn)AT10-N-HA,FAT10-C-HA，F(xiàn)AT10△GG-HA融合蛋白。我們將FAT10及各突變體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并使用26S蛋白酶體抑制劑MG132處理，通過(guò)Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生型FAT10及其突變體結(jié)合底物蛋白質(zhì)的活性，發(fā)現(xiàn)FAT10的C末端雙甘氨酸基團(tuán)以及雙泛素結(jié)構(gòu)域都是FAT10與底物共價(jià)結(jié)合所需的活性基團(tuán)，被FAT10標(biāo)記后的底物蛋白質(zhì)

4、通過(guò)26S蛋白酶體途徑降解。為了進(jìn)一步檢測(cè)FAT10及其N(xiāo)、C端結(jié)構(gòu)域降解底物蛋白質(zhì)的活性，我們成功構(gòu)建并表達(dá)了FAT10及其獨(dú)立的雙泛素結(jié)構(gòu)域標(biāo)記在EGFP蛋白質(zhì)N末端的融合蛋白，并通過(guò)Cycloheximide chase反應(yīng)檢測(cè)FAT10極其截?cái)嗤蛔凅w對(duì)EGFP降解的影響。發(fā)現(xiàn)FAT10極其雙泛素結(jié)構(gòu)域都具有促進(jìn)EGFP降解的活性。我們又通過(guò)Annexin-Ⅴ細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法檢驗(yàn)了FAT10極其截?cái)嗤蛔凅w對(duì)細(xì)胞凋亡活性的影響，發(fā)現(xiàn)