番茄E8基因啟動子功能域分析及PGENE轉(zhuǎn)化番茄研究.pdf

1、諾如病毒(Norovirus，NV)是導致人類非細菌性急性胃、腸炎的主要病原。疫苗是臨床防治諾如病毒疫情爆發(fā)的重要手段之一。對比諾如病毒的病毒樣顆粒（virus-likeparticles，VLPs）和P顆粒(Pparticles)與人組織血型抗原(humanHisto-BloodGroupAntigen，HBGA)親合力的研究發(fā)現(xiàn)，P顆粒的免疫原性要強于VLPs，因此我們設計用植物系統(tǒng)表達P顆粒，通過直接食用進行粘膜免疫起到防治諾如病

2、毒疫情的作用。并且，利用植物生物反應器生產(chǎn)外源蛋白具有安全性高、毒性低和易規(guī)模化生產(chǎn)的優(yōu)勢。直接食用還省去了分離純化的過程，大大降低了生產(chǎn)成本。
　　 E8基因啟動子(E8promoter)在番茄果實成熟早期調(diào)控E8基因在果實中特異地表達和對植物荷爾蒙-乙烯的應答。因其在成熟果實中特異性的表達，所以是用來在番茄成熟果實表達諾如病毒P顆粒的理想的基因工程工具。
　　 本研究首先以CaMV35S啟動子和E8全序列啟動子作對照

3、，通過分別缺失E8啟動子的-2181到-1528(Delα)，-1528到-1088(Delβ)，-1088到-863（Delγ），-863到-409(Delδ)，-409到-263(Delε)和-263到-1(Delξ)等六個區(qū)域，以綠色熒光蛋白基因(變種mgfp5)為驅(qū)動報告基因構(gòu)建載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化番茄品種黃櫻桃番茄NO.22，經(jīng)PCR和Southernblot確認獲得了獨立的轉(zhuǎn)基因番茄;檢測轉(zhuǎn)基因番茄缺失不同區(qū)域?qū)蟾婊蛟谵D(zhuǎn)錄和翻

4、譯水平的影響以及在不同組織中表達特異性的影響。
　　 根據(jù)Real-timePCR結(jié)果顯示，E8啟動子分六個區(qū)域功能區(qū)，α和δ兩個區(qū)域的缺失基本上不影響報告基因在番茄各組織中的表達;γ和(ξ)兩個區(qū)域的缺失雖然影響報告基因在番茄熟果中的表達，但調(diào)高了報告基因在番茄其他組織中的表達，如γ區(qū)域的缺失調(diào)高了報告基因在番茄青果中的表達，(ξ)區(qū)域的缺失調(diào)高了報告基因在番茄葉中的表達;β和ε兩個區(qū)域?qū)蟾婊蛟诜咽旃械谋磉_影響非常大，

5、應該是E8啟動子重要功能區(qū)。
　　 然后，我們根據(jù)番茄偏愛密碼子設計合成了表達諾如病毒毒株VA387的P顆粒的Pgene(1002bp)，并在其5'端融合了編碼His-tag(6×His)的DNA序列。構(gòu)建了含Pgene的原核載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichiacoli）菌株DH5α，在此基礎上，將Pgene置于E8啟動子下游，構(gòu)建了植物雙元表達載體質(zhì)粒E8::Pgene，并獲得了含該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105;通過農(nóng)桿菌介

6、導法轉(zhuǎn)化番茄品種黃櫻桃番茄22號（Lycopersiconesculentumvar.cerasiformeyellowcherryNo.22），并在相應培養(yǎng)基和條件下進行共培養(yǎng)、篩選和馴化，獲得抗性再生的109株，經(jīng)PCR和Southernblot確認獲得了6株獨立的轉(zhuǎn)基因番茄;轉(zhuǎn)Pgene番茄的RT-QPCR分析結(jié)果顯示，Pgene在轉(zhuǎn)錄水平上進行了表達，在成熟果中表達量達到最高;經(jīng)westernblot分析，轉(zhuǎn)基因番茄果實表達的P