共刺激分子B7-H3在食管癌中的表達及對食管癌細胞生物學特性的影響.pdf

1、惡性腫瘤嚴重威脅全球人類健康。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有多元性及復雜性，認識腫瘤發(fā)生發(fā)展機制和尋找治療腫瘤方法成為遏制腫瘤面臨的巨大挑戰(zhàn)。腫瘤免疫療法是繼手術、化療、放療后第四大有效的抗腫瘤療法。近年來，作為B7免疫球蛋白超家族的新成員，共刺激分子B7-H3在多種腫瘤組織異常高表達，并與腫瘤的生物學特性密切相關，被認為可能是一種新的腫瘤標志物和潛在的治療靶點。
　　目的:
　　本課題旨在通過檢測人食管鱗癌組織、相應癌旁正常組織及

2、食管鱗狀上皮不典型增生組織中B7-H3分子的表達，分析其與患者臨床病理因素以及術后生存時間之間的關系。檢測食管癌細胞株TE-1、TE-13、Eca-109細胞中B7-H3的表達，并通過靶向干擾B7-H3基因表達來研究B7-H3對食管癌細胞增殖、侵襲等生物學行為的影響。
　　方法:
　　1用免疫組織化學法檢測食管鱗癌組織、癌旁正常組織及食管鱗狀上皮不典型增生組織中B7-H3蛋白的表達以及CD8+T淋巴細胞的浸潤程度。
　

3、　2用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)方法檢測食管癌細胞株TE-1、TE-13、Eca-109中B7-H3的表達情況。
　　3用RT-PCR、Western Blot等方法檢測B7-H3 siRNA基因沉默后Eca-109細胞中B7-H3的mRNA和蛋白表達情況。
　　4通過MTT實驗分析沉默B7-H3后食管癌細胞的增殖活性。
　　5通過劃痕

4、實驗分析沉默B7-H3后食管癌細胞的遷移運動能力。
　　6通過Transwell實驗分析沉默B7-H3后食管癌細胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1免疫組化結(jié)果顯示，B7-H3陽性著色主要定位在腫瘤細胞的細胞質(zhì)和細胞膜。在82例ESCC患者中，B7-H3陽性率為98.8％。癌旁正常組織和食管鱗狀上皮不典型增生組織呈弱表達或不表達。食管癌組織中B7-H3表達水平與患者性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.

5、05）;與患者的年齡、腫瘤浸潤深度、TNM分期差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著患者腫瘤浸潤深度的增加，B7-H3的表達水平增加;臨床TNM分期越晚，B7-H3的表達越高。CD8免疫組化染色結(jié)果顯示，在82例食管癌組織中，CD8+T淋巴細胞低度浸潤36例，高度浸潤46例，與食管癌組織中B7-H3的表達水平呈負相關(P=0.003)。
　　2 RT-PCR結(jié)果顯示B7-H3在食管癌細胞TE-1(0.382±0.008)、TE-1

6、3(0.399±0.008)、Eca-109(0.428±0.012)中組成性表達，均屬于中低表達水平。其中Eca-109細胞中B7-H3的表達略高于其在TE-1、TE-13中的表達水平，但差異無統(tǒng)計學意義。
　　3 RT-PCR結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組(0.5403±0.0129)、轉(zhuǎn)染空載體組(0.5324±0.0072)相比，轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA質(zhì)粒48h可以使Eca-109細胞中B7-H3 mRNA表達水平(0.1285

7、±0.0017)降低(P＜0.01)。未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空載體組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。
　　4 Western Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA基因48h后，Eca-109細胞中B7-H3蛋白表達水平(0.4214±0.0048)顯著低于未轉(zhuǎn)染組(0.4921±0.0148)及空轉(zhuǎn)染組(0.5006±0.0129)的B7-H3蛋白表達(P＜0.05)。未轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)染組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。
　　5 MTT分

8、析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的Eca-109細胞接種于96孔板24h、48h、72h后，轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA的Eca-109細胞與空轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細胞相比，增殖率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明B7-H3 siRNA基因轉(zhuǎn)染對細胞增殖能力無顯著影響，差異無統(tǒng)計學意義。
　　6劃痕實驗結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組的Eca-109細胞24h后向劃痕邊緣爬行的速度快，細胞鋪展迅速，劃痕的寬度明顯變窄，有些細胞已經(jīng)爬行至劃痕的中央。而轉(zhuǎn)染

9、B7-H3 siRNA的Eca-109細胞向劃痕邊緣爬行的速度明顯減慢，劃痕缺損處修復緩慢。經(jīng)統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，B7-H3 siRNA轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組相比，劃痕間距明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA后，Eca-109細胞的平面運動能力明顯下降。
　　7 Transwell侵襲小室實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染B7-H3 siRNA后，通過人工基底膜的Eca-109細胞的數(shù)降低了大約50％。與未轉(zhuǎn)染

10、及空轉(zhuǎn)染組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？梢姵聊珺7-H3后，Eca-109細胞的體外侵襲能力明顯減弱。未轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)染組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1共刺激分子B7-H3在人食管癌組織中過度高表達，與腫瘤的進展、患者預后密切相關，有望成為監(jiān)測食管癌進展的重要指標。
　　2 B7-H3在食管癌中的表達與CD8+T淋巴浸潤程度呈負相關，可能參與腫瘤的免疫逃逸。
　　3沉默