姜黃素Ⅲ脂質體制備及其對肺癌細胞A549生物學特性的影響.pdf

1、肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其中80﹪以上是非小細胞肺癌(NSCLC),對放療、化療的敏感性差.腫瘤的生長、復發(fā)和轉移是影響患者預后的主要因素. 姜黃色素是中國傳統(tǒng)中藥姜黃的主要活性成分,包含姜黃素I(姜黃素)、姜黃素II(脫甲氧基姜黃素)和姜黃素Ⅲ(雙脫甲氧基姜黃素)3種單體.近年研究表明,姜黃色素可影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段(始發(fā)、促進和演進),并可通過抑制血管生成抗腫瘤的侵襲和轉移,其中以姜黃素Ⅲ的抗癌活性最強.作為一種有良好發(fā)

2、展前景的抗癌藥物,目前姜黃色素在腫瘤預防和治療方面的作用已經(jīng)引起人們的重視,成為研究熱點.但是,姜黃色素難溶于水,在體外也容易被氧化,難以進行靜脈給藥,目前也沒有穩(wěn)定性較好的藥物劑型,口服的姜黃素大部分也在胃腸道內被代謝而失活,被吸收到血循環(huán)中的量很少.由于上述原因,為姜黃素的臨床應用,特別是在肺癌等非胃腸道腫瘤治療中的使用帶來了一定的難度.脂質體包裹技術可解決脂溶性藥物不易溶于水的難題,提高易氧化藥物在體內外的穩(wěn)定性,降低被包封藥物的

3、毒性,增加藥物被增殖旺盛的癌細胞的攝取量,因此是抗腫瘤藥物的理想載體.鑒于此,該課題應用脂質體來包裹抗癌活性最強的姜黃素Ⅲ單體,并以肺腺癌A549細胞作為研究對象,旨在探討以脂質體作為載體制成能適合于靜脈使用的姜黃素新劑型的可能性,并進一步了解其對肺腺癌細胞生物學特性的影響,為姜黃素在肺癌治療當中應用的深入研究提供一定實驗基礎.方法:(一)姜黃素Ⅲ脂質體制備及大鼠體內藥代動力學實驗.1.姜黃素Ⅲ單體提取與脂質體制備.采用乙醇提取,硅膠柱

4、層析、丙酮純化的方法提取和分離姜黃色素單體,獲得所需要的姜黃素Ⅲ,以乙醇注入法制備姜黃素Ⅲ脂質體,檢測脂質體的包封率、粒徑大小和初步穩(wěn)定性.2.姜黃素Ⅲ脂質體在大鼠體內藥代動力學初步研究.比較姜黃素Ⅲ脂質體和游離姜黃素Ⅲ注射液在大鼠體內的藥代動力學,了解改變劑型后姜黃素Ⅲ脂質體在血藥代動力學參數(shù)上的變化,探討以脂質體為載體后,姜黃素Ⅲ靜脈應用的可能性.(二)姜黃素Ⅲ脂質體對人肺腺癌細胞A549生物學特性的影響.1.姜黃素Ⅲ脂質體對A54

5、9細胞的增殖影響.通過形態(tài)學觀察、MTT試驗、流式細胞儀檢測等研究加入姜黃素Ⅲ脂質體作用后,體外培養(yǎng)的A549細胞增殖活性和細胞周期的改變.2.姜黃素Ⅲ脂質體誘導A549細胞凋亡的實驗研究.丫啶橙染色,原位缺口末端標記檢測,透射電鏡進一步觀察姜黃素Ⅲ脂質體對A549細胞凋亡和壞死的影響,RT-PCR在mRNA水平檢測bcl-2基因的表達.主要實驗結果:1. 經(jīng)乙醇提取→石油醚脫脂→硅膠柱層析→丙酮純化的途徑提取和分離姜黃素活性單體效果良

6、好,操作簡便,并具有可重復性.2. 經(jīng)優(yōu)化后的乙醇注入法為制備的最佳方法,獲得的姜黃素Ⅲ脂質體平均包封率為87.89﹪,平均粒徑為130.5nm,粒徑分布均勻.藥物溶解度明顯增加,體外穩(wěn)定性明顯增加.3. 大鼠體內藥代動力學結果表明,姜黃素Ⅲ脂質體靜脈注射后消除半衰期為游離姜黃素Ⅲ注射液的1.22倍,AUC為1.95倍,清除率為0.5倍.提高注射濃度后,游離姜黃素Ⅲ因為溶解性差造成動物注射后即刻死亡明顯增加,而姜黃素Ⅲ脂質體在增加10倍

7、注射濃度后動物無一死亡,注射安全性顯著改善,且血藥濃度可明顯提高,AUC增加為13.58倍.4. 姜黃素Ⅲ脂質體和游離姜黃素Ⅲ均可對體外培養(yǎng)的A549細胞增殖活性產生明確影響(p<0.05),有劑量依賴性,其IC<,50>值分別為12.108ug·ml<'-1>和16.989ug·ml<'-1>.流式細胞儀檢測細胞周期主要被阻滯在S期.空白脂質體與陰性對照比較差異不顯著(p>0.05).5. 姜黃素Ⅲ脂質體促進A549細胞死亡可能包含誘

8、導凋亡和促進壞死兩種方式,15ug·ml<'-1>濃度時出現(xiàn)明顯凋亡,20ug·ml<'-1>濃度以上則以壞死為主.6.RT-PCR結果表明姜黃素Ⅲ脂質體和游離姜黃素Ⅲ作用后,A549細胞抗凋亡基因bcl-2在mRNA水平的表達均受到抑制,有一定劑量依賴性.結論:1.選擇脂質體作為姜黃素Ⅲ單體的藥物載體是可行的,包封率高,藥物溶解度和體外穩(wěn)定性明顯增加.2.脂質體包裹姜黃素Ⅲ后,其靜脈注射安全性得到顯著改善,注射后血藥濃度及曲線下面積均

9、明顯增加.脂質體劑型的制備有望解決姜黃色素不易靜脈給藥的難題,使實現(xiàn)姜黃素Ⅲ靜脈應用并達到有效血藥濃度成為可行.3.制備的姜黃素Ⅲ脂質體對體外培養(yǎng)人肺腺癌細胞A549的生物學特性有明確的影響,①可抑制細胞的惡性增殖,并阻滯細胞周期在S期,② 誘導細胞凋亡和促進細胞壞死.姜黃素Ⅲ脂質體的作用與陰性對照比較差異顯著,與游離姜黃素Ⅲ比較其抑制活性沒有減弱,表示其有可能在肺癌的治療中發(fā)揮作用.4.姜黃素Ⅲ脂質體和游離姜黃素Ⅲ作用后均可抑制bcl