嗜麥芽窄食單胞菌敏感株的適應(yīng)性耐藥及其初步機(jī)制.pdf

1、近年來，隨著廣譜抗生素的大量使用，致病力原本不強(qiáng)的條件致病菌嗜麥芽窄食單胞菌已然成為醫(yī)院感染的重要病原菌，致使感染率不斷上升，導(dǎo)致免疫力低下或長(zhǎng)期大量使用廣譜抗生素的人群呼吸道感染、心內(nèi)膜炎及敗血癥等危及生命的嚴(yán)重感染。體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)磺胺類、β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類等幾乎所有抗生素均可產(chǎn)生耐藥性。因此，目前國內(nèi)尚無學(xué)者對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌的感染提出統(tǒng)一的治療方案，一些學(xué)者的推薦方案僅基于回顧性研究和病例報(bào)

2、告，但嗜麥芽窄食單胞菌耐藥突變快速，因此其實(shí)用價(jià)值有限。國外學(xué)者推薦的治療方案也常有悖于藥敏試驗(yàn)結(jié)果和臨床治療結(jié)果，故對(duì)于該菌的治療，國內(nèi)外一致提倡根據(jù)藥敏結(jié)果選擇敏感抗生素進(jìn)行治療。 但臨床實(shí)踐證明，即使根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗生素，甚至聯(lián)合幾個(gè)同時(shí)敏感的抗生素進(jìn)行治療也不能使感染完全得到控制，這就是臨床上治療該菌時(shí)常見的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床治療結(jié)果不一致的現(xiàn)象，導(dǎo)致大量患者因不能有效控制感染而死亡。但對(duì)于這類常見現(xiàn)象，國內(nèi)學(xué)者長(zhǎng)

3、期以來不予重視，只是認(rèn)為由于該菌生長(zhǎng)緩慢而突變迅速造成了該結(jié)局，并未對(duì)其進(jìn)行深入研究。試驗(yàn)證明，該菌生長(zhǎng)并不緩慢而是生長(zhǎng)很快，并且如果發(fā)生了耐藥遺傳物質(zhì)突變應(yīng)該能從基因水平得以證實(shí)，但至今未見到該菌由于基因突變致使體外敏感性與臨床療效不一致的報(bào)道。 國外學(xué)者對(duì)其他革蘭陰性菌研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同類型的多種抗生素皆可誘導(dǎo)敏感菌產(chǎn)生暫時(shí)性耐藥，本文按國外慣用定義稱為適應(yīng)性耐藥。這種耐藥形式可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥表型暫時(shí)轉(zhuǎn)變，并認(rèn)為這種耐藥性使敏感

4、菌療效不佳，即適應(yīng)性耐藥引起敏感菌治療效果低下，但該現(xiàn)象一直未得到重視。這種耐藥性和有耐藥遺傳物質(zhì)介導(dǎo)的耐藥性不同，它不涉及基因組突變，因此臨床微生物實(shí)驗(yàn)室不能檢測(cè)出來，更不知其發(fā)生規(guī)律，無法報(bào)告臨床。在特定條件下，敏感的嗜麥芽窄食單胞菌能否產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥，這種耐藥有無規(guī)律，其發(fā)生機(jī)制是什么，闡明這些，可為臨床治療嗜麥芽窄食單胞菌敏感株作出提示，避免適應(yīng)性耐藥發(fā)生。 嗜麥芽窄食單胞菌中Ⅰ型整合子介導(dǎo)的復(fù)方新諾明耐藥基因的發(fā)現(xiàn)，將

5、導(dǎo)致該抗生素耐藥傳播迅速，其應(yīng)用會(huì)受到限制。喹諾酮類治療嗜麥芽窄食單胞菌時(shí)易誘發(fā)敏感株突變，造成多種抗生素耐藥致使治療失敗?？梢?，該菌本身耐藥變遷快速，耐藥機(jī)制復(fù)雜，不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)根據(jù)當(dāng)?shù)啬退幈O(jiān)測(cè)結(jié)果選擇符合當(dāng)?shù)啬退幪攸c(diǎn)的抗生素進(jìn)行治療，所以各地治療方案不盡相同。而對(duì)于由該菌引起的危及生命的嚴(yán)重感染，除了采用國外推薦的復(fù)方新諾明和喹諾酮類治療外，仍有很多地方根據(jù)藥敏報(bào)告采用阿米卡星或慶大霉素聯(lián)合其他抗生素進(jìn)行治療。鑒于上述原因以及中國藥品

6、管理局規(guī)定和參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)假單胞菌的選藥指南，本文選用對(duì)慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明皆敏感的嗜麥芽窄食單胞菌，對(duì)其誘導(dǎo)處理后，再檢測(cè)其能否對(duì)原本敏感的上述四種抗生素產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生規(guī)律及初步探討其耐藥機(jī)制。 目的： （1）篩選出左氧氟沙星，復(fù)方新諾明，慶大霉素和阿米卡星表型敏感且不含抗慶大霉素和阿米卡星修飾酶基因的敏感菌作為受試菌。 （2）分別測(cè)定受試菌對(duì)慶大霉素、

7、阿米卡星、復(fù)方新諾明和左氧氟沙星的最低抑菌濃度值（MIC）和最低殺菌濃度值（MBC）。 （3）誘導(dǎo)受試菌適應(yīng)性耐藥，檢測(cè)處于適應(yīng)性耐藥期細(xì)菌的廣譜耐藥性。 （4）測(cè)定不同耐藥時(shí)期菌體內(nèi)抗生素含量。 （5）測(cè)定不同耐藥時(shí)期菌體外膜蛋白構(gòu)成，對(duì)有差異的蛋白進(jìn)行序列測(cè)定，確定有差異的蛋白類型。 方法： （1）用K-B法對(duì)收集到的88株嗜麥芽窄食單胞菌臨床分離株做藥敏試驗(yàn)，篩選出對(duì)慶大霉素、阿米卡星、復(fù)方

8、新諾明和左氧氟沙星敏感株。再用7對(duì)抗慶大霉素和阿米卡星的修飾酶基因引物對(duì)全部株進(jìn)行擴(kuò)增，收集不含任何一種氨基糖苷修飾酶基因且4種抗生素全為敏感的菌株作為受試菌。用液體稀釋法測(cè)定受試菌對(duì)上述4種抗生素的MIC值和MBC值； （2）將受試菌因?yàn)樘幚矸椒ú煌譃樵囼?yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組只是在誘導(dǎo)階段不加抗生素誘導(dǎo)即空白誘導(dǎo)，其余處理與試驗(yàn)組完全相同。以1×MIC慶大霉素/阿米卡星分別誘導(dǎo)試驗(yàn)組細(xì)菌1h，再以4×MIC濃度的慶大霉素鄺可米

9、卡星殺菌1h，計(jì)算殺菌速度，比較試驗(yàn)組平均殺菌速度和對(duì)照組平均殺菌速度大小。若抗生素對(duì)試驗(yàn)組的殺菌速度小于對(duì)對(duì)照組的殺菌速度表示誘導(dǎo)使細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性；如果兩組殺菌速度相同則誘導(dǎo)不產(chǎn)生耐藥性；如果對(duì)試驗(yàn)組殺菌速度大于對(duì)照組殺菌速度表示誘導(dǎo)使試驗(yàn)組細(xì)菌產(chǎn)生了敏感性。以阿米卡星誘導(dǎo)細(xì)菌后，再分別用復(fù)方新諾明／左氧氟沙星進(jìn)行殺菌，證實(shí)誘導(dǎo)菌能否使復(fù)方新諾明／左氧氟沙星敏感性降低。 （3）鑒于測(cè)定抗生素含量費(fèi)用昂貴，故本試驗(yàn)只檢測(cè)01號(hào)

10、菌誘導(dǎo)后第2、4、6、8、10h吸收慶大霉素和阿米卡星的量來評(píng)價(jià)誘導(dǎo)后不同時(shí)段（第2、4、6、8、10h）抗生素進(jìn)入菌體的情況。具體操作如下：一邊做誘導(dǎo)試驗(yàn)（誘導(dǎo)試驗(yàn)同前），一邊同步收集誘導(dǎo)后第2、4、6、8和10h并加入了抗生素至終濃度為10μg/ml，且殺菌1h的細(xì)菌。當(dāng)誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果證明誘導(dǎo)耐藥成功后，所收集的細(xì)菌方能用于測(cè)定抗生素含量。離心去除培養(yǎng)上清，PBS（pH7.0）洗滌沉淀2次，去除PBS后再加新的PBS混勻細(xì)菌懸液，超聲

11、破菌。取超聲后的菌液一滴涂片染色，鏡下確定全部菌體都破裂。離心收集上清，上清液中的抗生素含量就是不同耐藥時(shí)期的細(xì)菌吸收至體內(nèi)的抗生素。采用高效液相色譜法測(cè)定此液體中的抗生素含量； （4）Carlone法提取受試菌誘導(dǎo)后第1h～第10h的外膜蛋白（outer membrane protein，OMP），聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析OMP的構(gòu)成成分；對(duì)有變化的外膜蛋白溶液送交蛋白測(cè)序公司進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在G

12、eneBank中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，確定所測(cè)外膜蛋白的種類。 結(jié)果： （1）K-B法和PCR法篩選出符合條件的受試菌3株，分別命名為01、02、03號(hào)菌株。01、02、03號(hào)菌對(duì)各抗生素的最低抑菌濃度（MIC）值（μg/ml）和最低殺菌濃度（MBC）值（μg／ml）分別如下：慶大霉素的MIC值分別是0.5、1、0.5；慶大霉素的MBC值分別是1.5、2.5、1.5；阿米卡星的MIC值分別是0.25、0.5、0.5；阿米卡

13、星的MBC值分別是0.5、1.5、1；復(fù)方新諾明的MIC值分別是0.25、0.25、0.25；復(fù)方新諾明的MBC值分別是0.5、0.5、0.5；左氧氟沙星的MIC值分別是0.25、0.25、0.5；左氧氟沙星的MIC值分別是0.5、0.5、1； （2）誘導(dǎo)后試驗(yàn)組細(xì)菌對(duì)4種抗生素均產(chǎn)生耐藥性，即從誘導(dǎo)后第4h～第8h抗生素殺菌能力減弱甚至失去殺菌力即產(chǎn)生了適應(yīng)性耐藥。從誘導(dǎo)后第9h以后，抗生素開始逐漸恢復(fù)殺菌能力即細(xì)菌逐漸失去耐

14、藥性又變?yōu)槊舾芯?。?duì)照組細(xì)菌沒有這種規(guī)律性變化； （3）01號(hào)菌試驗(yàn)組細(xì)菌在誘導(dǎo)后第2、4、6、8和10小時(shí)的慶大霉素含量（μg／ml）情況分別是：1.69、0.81、0.32、0.71和1.57；對(duì)照組細(xì)菌誘導(dǎo)后第2、4、6、8和10小時(shí)的慶大霉素含量（μg/ml）情況分別是：1.71、1.76、1.69、1.73和1.8。01號(hào)菌試驗(yàn)組細(xì)菌在誘導(dǎo)后第2，4，6，8和10小時(shí)的阿米卡星含量（μg／ml）情況分別是：1.56、0

15、.66、0.29、0.59和1.37；對(duì)照組細(xì)菌誘導(dǎo)后第2、4、6、8和10小時(shí)的阿米卡星含量（μg／ml）情況分別是：1.73、1.75、1.69、1.74和1.79。 （4）收集誘導(dǎo)后不同時(shí)段的細(xì)菌，分別提取其外膜蛋白（outer membraneprotein，OMP），SDS-PAGE電泳顯示耐藥高峰期試驗(yàn)菌在45kD處及60kD的OMP表達(dá)幾乎消失；對(duì)45kD處及60kD的OMP進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定，測(cè)定序列與美國國家生

16、物信息中心的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，45kD處的蛋白與提交到生物信息中心的該菌的氨基酸運(yùn)輸跨膜蛋白完全同源（amino-acid transporter transmembrane protein），全長(zhǎng)475aa；60kD處的外膜蛋白測(cè)序結(jié)果與生物信息中心報(bào)道的該菌外膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（putative transfer protein）完全同源，全長(zhǎng)823aa。 結(jié)論： （1）慶大霉素和阿米卡星能誘導(dǎo)嗜麥芽窄食單胞菌

17、產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥，試驗(yàn)用的4種抗生素皆對(duì)適應(yīng)性耐藥期細(xì)菌的殺菌能力減弱。由于受試菌沒有耐藥基因，可見沒有耐藥基因的變化，耐藥表型也能發(fā)生變化，即嗜麥芽窄食單胞菌中，耐藥不完全由耐藥基因決定； （2）該菌中，某些耐藥表型是動(dòng)態(tài)變化著的，其轉(zhuǎn)變有時(shí)限性，即經(jīng)過一定時(shí)間之后，其表型又可回復(fù)到始發(fā)狀態(tài)，揭示了該菌耐藥的復(fù)雜性和傳統(tǒng)耐藥性檢測(cè)的粗糙； （3）誘導(dǎo)后細(xì)菌吸收抗生素的變化步調(diào)與細(xì)菌發(fā)生適應(yīng)性耐藥步調(diào)基本一致，提示耐藥表型