造血干細(xì)胞體內(nèi)衰老模型的構(gòu)建及相關(guān)生物學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 生、老、病、死是生命的自然規(guī)律。衰老是機(jī)體發(fā)育成熟以后伴隨著時(shí)間的推移體內(nèi)各種細(xì)胞、組織與器官逐漸發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能不可逆轉(zhuǎn)的、全面的衰退過(guò)程。最新研究認(rèn)為：生物體的衰老實(shí)際上是其體內(nèi)干細(xì)胞的衰老，所有的衰老現(xiàn)象包括組織器官退化、功能喪失、腫瘤發(fā)生和反復(fù)感染等都是成體干細(xì)胞衰老水平的具體表現(xiàn)。因此，深入研究干細(xì)胞衰老的機(jī)理對(duì)預(yù)防和治療老年性疾病有重要理論意義與臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 實(shí)驗(yàn)證明，造血干細(xì)胞（HSC）

2、的衰老與機(jī)體衰老有著密切的關(guān)系。HSC衰老是指細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，不可逆的停留在GI期，自我更新和多向分化能力降低，細(xì)胞數(shù)量減少，應(yīng)激性凋亡升高。HSC衰老可以引起機(jī)體造血功能和免疫功能的衰退、腫瘤發(fā)生率增加，并導(dǎo)致機(jī)體重要臟器結(jié)構(gòu)與功能的衰退。目前對(duì)HSC衰老機(jī)理還了解甚少，如果能闡明HSC衰老的生物學(xué)機(jī)理，尋找到延緩其衰老途徑，無(wú)疑對(duì)防治老年性疾病有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。衰老模型的構(gòu)建與相關(guān)生物學(xué)檢測(cè)是研究HSC衰老機(jī)理的重要基礎(chǔ)

3、性工作，迄今仍未見(jiàn)理想和公認(rèn)的HSC體內(nèi)衰老模型。本研究以C57小鼠為研究對(duì)象，采用雄性供體HSC連續(xù)性移植建立小鼠的HSC復(fù)制性衰老的體內(nèi)模型，并通過(guò)整體、細(xì)胞和分子水平對(duì)HSC衰老的生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)，旨在為研究HSC衰老機(jī)理以及延緩其衰老的途徑提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.免疫磁性分選法（MACS）分離、純化雄性C57小鼠Sca-1+HSC，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）鑒定分選細(xì)胞純度，免疫熒光檢測(cè)分選HS

4、C Sca-1+抗原的表達(dá)，臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)分選Sca-1+HSC的活性。
　　 2.用雄性供體HSC連續(xù)尾靜脈移植給雌性受體鼠，建立小鼠HSC復(fù)制性衰老體內(nèi)模型；經(jīng)PCR分析Y染色體基因，鑒定受體鼠造血細(xì)胞是否來(lái)源于雄性供體；觀察移植后受體鼠脾結(jié)節(jié)（CFU-S）形成數(shù)量、測(cè)定脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)，觀察移植HSC后受體鼠外周血血象指標(biāo)（WBC，RBC以及PLT）的恢復(fù)，以觀察受體鼠造血功能重建情況。
　　 3.采用造血祖細(xì)

5、胞混合性集落（CFU-Mix）培養(yǎng)、細(xì)胞周期測(cè)定和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β）染色，觀察連續(xù)移植所致衰老HSC自我更新和多向分化能力的生物學(xué)特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.小鼠Sca-1+HSC分離純化及鑒定
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MACS前骨髓單個(gè)核細(xì)胞（MNCs）中Sca-1+HSC百分比僅為1.7％；MACS分離純化后Sca-1+HSC純度可達(dá)87.2％以上。免疫熒光觀察顯示，分選前MNCs中僅有極少數(shù)

6、細(xì)胞表達(dá)Sca-1+抗原，MACS分離純化后標(biāo)記的細(xì)胞中見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)Sca-1+抗原。臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)分選的Sca-1+HSC活性為96％～99％。提示分選的Sca-1+細(xì)胞有較高純度和活性。
　　 2.供體HSC連續(xù)移植后受體鼠脾結(jié)節(jié)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及外周血
　　 血象檢測(cè)
　　 2.1雄性供體HSC連續(xù)移植2次后，其在受體小鼠脾臟上形成CFU-S的能力下降。
　　 2.2雄性供體HSC連續(xù)移植

7、2次后，受體小鼠的脾臟和胸腺重量減輕，脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)皆有明顯下降。
　　 2.3雄性供體HSC連續(xù)移植2次后，受體小鼠WBC，RBC、PTC以及HCT均有所降低，提示在連續(xù)移植中HSC的自我更新及重建造血的能力下降。
　　 3.Y染色體檢測(cè)
　　 經(jīng)Y染色體PCR分析，結(jié)果顯示受體鼠的造血細(xì)胞均能檢測(cè)出342bp的Y染色體序列（Sry序列），證明雌性受體小鼠重建造血的細(xì)胞來(lái)源于雄性供體小鼠HSC。
　　

8、 4.連續(xù)移植所致HSC衰老的生物學(xué)檢測(cè)
　　 4.1隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加，其形成CFU-Mix集落數(shù)量和形成集落的細(xì)胞數(shù)明顯降低。
　　 4.2隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加，細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少。
　　 4.3隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加，SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯增高。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用MACS能成功、有效的分離、純化雄