正常人與肺結(jié)核病人rhIL-2擴(kuò)增的CD3+CD56+NKT細(xì)胞生物學(xué)活性的比較研究.pdf

1、研究背景：ΝΚΤ（natural killer T)細(xì)胞是一群細(xì)胞表面既有T細(xì)胞受體(TCR)，又有NK細(xì)胞受體的特殊T細(xì)胞亞群。該群細(xì)胞具有抗感染，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等多重功能。雖然共表達(dá)T細(xì)胞受體和NK細(xì)胞受體可以作為NKT細(xì)胞的表型指標(biāo)，但是NKT細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的異質(zhì)性群體，其確切的定義仍未取得一致意見。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn) CD3+CD56+NKT細(xì)胞是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer，CIK)中的

2、主要效應(yīng)細(xì)胞，其含量的多少與CIK的細(xì)胞毒活性的高低有關(guān)。目前 CIK過繼免疫治療腫瘤的方法在臨床已得到應(yīng)用，但是針對(duì)結(jié)核病的細(xì)胞過繼免疫療法還很少研究。由于結(jié)核病的致病菌結(jié)核桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體對(duì)它的消滅也依賴細(xì)胞免疫，所以有關(guān)結(jié)核病的細(xì)胞過繼免疫療法的研究有望成為攻克結(jié)核病的一個(gè)全新的領(lǐng)域。
　　目的：從活化規(guī)律、細(xì)胞數(shù)量、表型和分泌細(xì)胞因子四方面比較正常人與肺結(jié)核病人新鮮外周血中 CD3+CD56+NKT細(xì)胞的差異；分

3、別觀察正常人與肺結(jié)核病人PBMC(peripheral blood mononuclear cells)用rhIL-2刺激后CD3+CD56+NKT細(xì)胞的增殖規(guī)律，再?gòu)募?xì)胞數(shù)量、表型和分泌細(xì)胞因子三方面比較正常人與肺結(jié)核病人rhIL-2擴(kuò)增后的CD3+CD56+NKT細(xì)胞的差異，以期為探討肺結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制和治療方法開辟一個(gè)新的道路。
　　方法：
　　1.淋巴細(xì)胞各亞群的檢測(cè)方法：正常人與肺結(jié)核病人外周靜脈血收集于肝素鈉抗凝

4、的真空采血管內(nèi)，于4小時(shí)內(nèi)完成流式抗體染色處理過程，利用流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)并分析結(jié)果，最終得出淋巴細(xì)胞各亞群的數(shù)值。
　　2.活化指標(biāo) CD69的檢測(cè)方法：密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用rhIL-2刺激PBMC，分別于刺激后0、8、16、40和64小時(shí)檢測(cè)NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞表面CD69的表達(dá)情況。
　　3. rhIL-2擴(kuò)增 NKT細(xì)胞的方法：密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，加入 rhI

5、L-2刺激培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，以后每2-3天補(bǔ)充rhIL-2和新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞兩周，分別于培養(yǎng)第0、6、10和14天檢測(cè)NKT細(xì)胞比例并計(jì)數(shù)。
　　4. NKT細(xì)胞的表型和胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)：于培養(yǎng)第0天和第14天收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)NKT細(xì)胞的表面分子γδTCR、CD4、CD8和CD161的表達(dá)情況以及胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-17的分泌量。
　　結(jié)果:

6、
　　1.肺結(jié)核病人(n=42)與正常人(n=30)相比，NKT細(xì)胞和 Th細(xì)胞比例未發(fā)生顯著變化，NK細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，Th/Tc比值顯著增加(P<0.01)，而T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、Tc細(xì)胞和B細(xì)胞都顯著降低(P<0.01)。
　　2. PBMC經(jīng)rhIL-2刺激0h、8h、16h、40h和64h后，正常人NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞表面CD69表達(dá)量均顯著增加（與0 h比較，P<0.01）。肺結(jié)核病人NK細(xì)胞和N

7、KT細(xì)胞表面CD69表達(dá)量也顯著增加（與0 h比較，P<0.01）。肺結(jié)核病人組與正常組比較，NK細(xì)胞表面CD69表達(dá)量除0 h無顯著差異（P>0.05），其余各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均高于正常組（P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.05）；NKT細(xì)胞表面CD69表達(dá)量除64 h無顯著差異（P>0.05），其余各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均高于正常組（P<0.01、P<0.05、P<0.05、P<0.01）。
　　3.正常人PBMC在rhI

8、L-2刺激培養(yǎng)14天后，細(xì)胞總數(shù)由（0.86±0.18）×106擴(kuò)增到（38.28±4.56）×106（P<0.01），細(xì)胞擴(kuò)增了45.79±7.77倍；NKT細(xì)胞絕對(duì)數(shù)則由（5.57±5.16）×104擴(kuò)增到（1475.05±868.98）×104（P<0.01），細(xì)胞擴(kuò)增了246.26±134.06倍；NKT細(xì)胞相對(duì)比例由（5.14±2.11）％擴(kuò)增到（38.57±21.95）%（P<0.01）。結(jié)核病人外周血單個(gè)核細(xì)胞在rhIL-

9、2刺激下也會(huì)顯著擴(kuò)增，細(xì)胞總數(shù)由（0.95±0.19）×106擴(kuò)增到（18.15±1.73）×106（P<0.01），細(xì)胞擴(kuò)增了19.77±4.82倍；NKT細(xì)胞絕對(duì)數(shù)由（3.44±1.20）×104擴(kuò)增到（323.23±75.98）×104（P<0.01），細(xì)胞擴(kuò)增了108.69±59.22倍；NKT細(xì)胞相對(duì)比例由（3.67±1.25）%擴(kuò)增到（17.67±3.23）%（P<0.01）。兩組比較，肺結(jié)核病人NKT細(xì)胞擴(kuò)增效率顯著低于正

10、常人。
　　4.正常人外周血中NKT細(xì)胞高表達(dá)CD8，擴(kuò)增后的NKT細(xì)胞則高表達(dá)γδTCR、CD161；結(jié)核病人外周血中NKT細(xì)胞CD8表達(dá)量低于正常人，擴(kuò)增后NKT細(xì)胞γδTCR降低， CD8、CD4、CD161的表達(dá)量則增高，γδTCR、CD4的表達(dá)量低于正常人，CD8、CD161的表達(dá)量則高于正常人。
　　5.正常人外周血中NKT細(xì)胞能夠分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17，擴(kuò)增后NKT細(xì)胞分泌IFN-γ、

11、TNF-α的量顯著增加；肺結(jié)核病人外周血中NKT細(xì)胞也能夠分泌 IFN-γ、TNF-α、IL-4和 IL-17，但擴(kuò)增前后這些細(xì)胞因子的量無差異；正常人擴(kuò)增后的NKT細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α的量顯著高于肺結(jié)核病人。
　　結(jié)論：
　　1.肺結(jié)核病人的T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、Tc細(xì)胞和B細(xì)胞低于正常人，NK細(xì)胞、Th/Tc比值高于正常人，而NKT細(xì)胞、Th細(xì)胞則與正常人相似。
　　2.肺結(jié)核病人NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞的活化