高表達(dá)P2X7受體抑制宮頸癌Caski細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測(cè)宮頸癌Caski細(xì)胞表面是否表達(dá)有功能的P2X7受體；探討在Caski細(xì)胞上穩(wěn)定高表達(dá)P2X7受體后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；進(jìn)一步探討外源性三磷酸腺苷(ATP)對(duì)高表達(dá)P2X7受體的Caski細(xì)胞的生長(zhǎng)影響。
　　方法：(1)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、免疫組化技術(shù)檢測(cè)宮頸癌上P2X7受體的表達(dá)。(2)將質(zhì)粒pcDNA6/V5-His-P2X7轉(zhuǎn)染至Caski細(xì)胞,用RT-PCR、Wester

2、n blotting、細(xì)胞免疫熒光等方法檢測(cè)P2X7受體在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位,為檢測(cè)高表達(dá)P2X7受體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。(3)進(jìn)一步檢測(cè)P2X7受體的天然配體ATP處理后對(duì)高表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,用MTT檢測(cè)細(xì)胞生存率,熒光染色法檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化,FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以及Western blotting分析凋亡相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果：(1) RT-PCR、FCM、免疫組化結(jié)果表明在宮頸癌Caski

3、細(xì)胞上P2X7受體的表達(dá)減少。(2)穩(wěn)定細(xì)胞株的建立：通過(guò)抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)P2X7的Caski細(xì)胞株(Caski/P2X7)和陰性對(duì)照細(xì)胞株(Caski/3.1)。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA6/V5-His-P2X7的Caski細(xì)胞出現(xiàn)約180bp條帶,陰性對(duì)照細(xì)胞株(Caski/3.1)無(wú)條帶出現(xiàn);Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA6/V5-His-P2X7的Caski細(xì)胞出現(xiàn)約75KDa的目的條帶

4、;熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果顯示在Caski細(xì)胞膜上有紅色熒光,表明有P2X7的蛋白表達(dá),而陰性對(duì)照細(xì)胞未見(jiàn)熒光。MTT分析高表達(dá)P2X7受體后可抑制Caski細(xì)胞增殖。(3)用ATP處理Caski/P2X7和Caski/3.1細(xì)胞后,與對(duì)照細(xì)胞Caski/3.1比較,ATP處理后抑制Caski/P2X7細(xì)胞增殖較明顯(*,p<0.05);隨著ATP濃度的增加FCM結(jié)果顯示Caski/P2X7細(xì)胞凋亡率逐漸增加及線(xiàn)粒體膜電位逐漸降低;West