p38δ影響宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：本課題旨在探討p38δ在宮頸癌組織細(xì)胞和Hela細(xì)胞系中蛋白表達(dá)水平的變化，及p38δ高表達(dá)對Hela細(xì)胞凋亡的影響，同時初步探討p38δ在該調(diào)控過程中可能存在的分子機制，從而為宮頸癌的篩查、診斷及臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.利用蛋白免疫印跡（western blot）法檢測宮頸癌組織細(xì)胞及Hela細(xì)胞系中p38δ蛋白表達(dá)水平；
　　2.利用瞬時轉(zhuǎn)染p38δ哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒，在Hela細(xì)胞中瞬時過

2、表達(dá)p38δ；
　　3.利用Annexin V-FITC/PI雙染色熒光顯微鏡觀察法檢測Hela細(xì)胞瞬時過表達(dá)p38δ后細(xì)胞凋亡水平的變化；
　　4.利用慢病毒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞耐藥性篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)p38δHela細(xì)胞株；
　　5.利用蛋白免疫印跡法和細(xì)胞免疫熒光染色法檢測穩(wěn)定表達(dá)p38δ Hela細(xì)胞株中p38δ的表達(dá)情況；
　　6.利用Annexin V-FITC/PI雙染色熒光顯微鏡觀察法檢測對照Hela細(xì)胞株和

3、穩(wěn)定表達(dá)p38δ Hela細(xì)胞株在缺氧條件（1％O2，24h）和順鉑處理條件（10ug/ml，24h）下細(xì)胞凋亡水平；
　　7.利用免疫沉淀（immunoprecipitation）法和蛋白免疫印跡法檢測缺氧條件（1%O2，24h）和順鉑（10ug/ml，24h）處理條件下p38δ磷酸化水平；
　　8.利用瞬時轉(zhuǎn)染野生型p38δ表達(dá)質(zhì)粒和激酶失活突變體p38δ(K54R)表達(dá)質(zhì)粒，以及Annexin V-FITC/PI雙染色

4、熒光顯微鏡觀察法，檢測野生型p38δ和激酶失活突變p38δ(K54R)對Hela細(xì)胞凋亡的影響；
　　9.采用蛋白免疫印跡法檢測對照Hela細(xì)胞株和穩(wěn)定表達(dá)p38δ Hela細(xì)胞株在缺氧條件（1% O2，24h）和順鉑處理條件（10ug/ml，24h）下，細(xì)胞中凋亡調(diào)控因子p53、Bcl-2及Bax的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中p38δ蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.

5、05）；與非癌性細(xì)胞系HEK293(human embryonic kidney293)細(xì)胞、MEF(Mouse embryo fibroblast)細(xì)胞相比，宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞中p38δ蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；
　　2.與轉(zhuǎn)染空白對照載體Hela細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染p38δ表達(dá)載體Hela細(xì)胞凋亡水平顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；
　　3.與對照Hela細(xì)胞株相比，穩(wěn)定表達(dá)p3

6、8δ Hela細(xì)胞株在缺氧條件及順鉑處理條件下細(xì)胞凋亡水平顯著提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p均<0.05）；
　　4.與對照處理細(xì)胞相比，缺氧及順鉑處理后Hela細(xì)胞中p38δ第180位蘇氨酸和第182位酪氨酸磷酸化水平顯著提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p均<0.05）；
　　5.與轉(zhuǎn)染野生型p38δ表達(dá)載體Hela細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染p38δ激酶失活突變表達(dá)載體Hela細(xì)胞凋亡水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；
　

7、　6.與對照Hela細(xì)胞株相比，穩(wěn)定表達(dá)p38δHela細(xì)胞株在缺氧及順鉑處理條件下，凋亡調(diào)控因子Bax和p53蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p均<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在宮頸癌組織細(xì)胞和在宮頸癌Hela細(xì)胞中，p38δ的蛋白表達(dá)水平降低；
　　2.Hela細(xì)胞中高表達(dá)p38δ促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并且促進(jìn)Hela細(xì)胞對低氧環(huán)境及順鉑的敏感度；
　　3.低氧環(huán)境