P2X7受體介導(dǎo)2型糖尿病單核巨噬細(xì)胞免疫炎癥的調(diào)控作用研究.pdf

1、背景：糖尿?。―iabetes mellitus,DM）已成為世界第三大疾病，其發(fā)病率和對(duì)人類健康的危險(xiǎn)性僅次于癌癥和心腦血管疾病。其中脂類代謝異常（如游離脂肪酸）在2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus,T2DM）的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，同時(shí)2型糖尿病也是一種低度炎癥性疾病。胰島素抵抗過(guò)程中的炎性反應(yīng)常引起機(jī)體異常炎癥因子的產(chǎn)生、急性期反應(yīng)蛋白的增加以及炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。單核/巨噬細(xì)胞作為先天性免疫和適應(yīng)性

2、免疫的重要參與者，可通過(guò)分泌細(xì)胞因子及抗原提呈等作用影響并調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。在炎癥狀態(tài)下，三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）可從應(yīng)激細(xì)胞或死亡細(xì)胞中被動(dòng)地釋放到細(xì)胞外，它通過(guò)與細(xì)胞膜上的相關(guān)嘌呤受體亞型（如P2X7受體）結(jié)合發(fā)揮不同的生理作用。P2X7受體是以ATP為配體的非選擇性陽(yáng)離子門控通道，在多種炎性病理狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)進(jìn)而影響炎性介質(zhì)的釋放，參與炎性和免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷或凋亡等過(guò)程。長(zhǎng)鏈非

3、編碼核糖核酸（long non-coding RNAs,lncRNAs）一般是指長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸、位于細(xì)胞核或胞漿內(nèi)、缺乏編碼蛋白質(zhì)的能力、以RNA形式在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的一種RNA。lncRNAs具有重要的生理學(xué)功能并參與某些疾病的病理變化過(guò)程。Uc.48+的長(zhǎng)度為298bp，屬長(zhǎng)鏈非編碼RNA。
　　研究證實(shí)在非糖尿病人群中，C反應(yīng)蛋白（C reactive protein,CRP）水平可以

4、預(yù)測(cè)2型糖尿病的發(fā)病，且其不受肥胖、脂肪分布和胰島素抵抗等因素的影響；同時(shí)CRP直接參與了炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病，也是2型糖尿病并發(fā)的冠心病最強(qiáng)有力的預(yù)示因子與危險(xiǎn)因子。脂類代謝異常可造成脂質(zhì)沉積或脂毒性而引起β細(xì)胞功能紊亂。雖然正常的脂肪酸(如磷脂)具有維持細(xì)胞膜完整性的作用，但如果游離脂肪酸濃度異常增加可誘導(dǎo)多種信號(hào)途徑（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧、凋亡、炎癥途徑等）功能異常出現(xiàn)脂毒性損傷。在炎癥狀態(tài)下，外周單核細(xì)胞進(jìn)入組織分化形成

5、巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞可通過(guò)釋放一系列的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子而召集其它細(xì)胞（如纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）影響相關(guān)組織的功能。2型糖尿病患者可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子激活補(bǔ)體，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附因子，使內(nèi)皮功能受損，加速炎性反應(yīng)過(guò)程。P2X7受體廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞（如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等）中, P2X7受體激活后可增加免疫細(xì)胞分泌的炎性因子進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,同時(shí)可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞及T細(xì)胞功能來(lái)調(diào)控免疫反應(yīng)。本研究第一部分將通過(guò)

6、觀察在高糖高脂處理下，P2X7受體介導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的改變，探討其在免疫炎癥反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制。
　　在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與脂質(zhì)代謝具有相互協(xié)同的特點(diǎn)，炎癥可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)代謝異常也可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。研究表明巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)到組織修復(fù)轉(zhuǎn)換中扮演重要角色，可決定受傷部位的最終命運(yùn)。LncRNAs具有組織特異性，在多種組織中均可表達(dá)，細(xì)胞分泌的lncRNAs常表現(xiàn)為疾

7、病、組織、發(fā)展階段等多方面特異性，此特征可使其成為生物標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)。LncRNAs表達(dá)異常與一些疾病的病理變化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到高糖高脂處理導(dǎo)致巨噬細(xì)胞uc.48+表達(dá)上調(diào)，提示uc.48+涉及相關(guān)病理變化。目前尚未見uc.48+在單核巨噬細(xì)胞的研究報(bào)道。因此，本項(xiàng)研究第二部分將應(yīng)用lncRNA uc.48+siRNA對(duì)高糖高脂處理下RAW264.7巨噬細(xì)胞P2X7受體介導(dǎo)的糖尿病炎性病理?yè)p傷的影響，探討uc.48+在2型糖尿病巨噬

8、細(xì)胞P2X7受體介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制。
　　2型糖尿病狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)造成脂肪組織、肝臟、肌肉及胰腺均處于炎癥狀態(tài)。研究表明組織中的巨噬細(xì)胞狀態(tài)對(duì)2型糖尿病的發(fā)生及進(jìn)展均具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用。另一方面，特定組織中異常的lncRNAs表達(dá)可造成人體生物學(xué)功能紊亂從而引發(fā)各種疾病，如lncRNAs可能參與了胰島素的代謝效應(yīng)及胰島素抵抗的發(fā)展過(guò)程。本項(xiàng)研究第三部分將觀察lncRNA uc.48+siRNA對(duì)2型糖尿病

9、模型小鼠血糖血壓及神經(jīng)病理變化的影響及其對(duì)P2X7受體介導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞病理變化的影響，探討uc.48+在2型糖尿病小鼠及其腹腔巨噬細(xì)胞病理變化中的作用。
　　目的：
　　1、觀察2型糖尿病CRP正常組、2型糖尿病CRP升高組、正常對(duì)照組3組人群的臨床檢測(cè)指標(biāo)、外周血單核細(xì)胞P2X7受體表達(dá)的差異。通過(guò)觀察在高糖高脂處理下，P2X7受體介導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的改變，探討其在免疫炎癥反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制

10、。
　　2、觀察2型糖尿病CRP正常組、2型糖尿病CRP升高組、正常對(duì)照組3組人群血清uc.48+及細(xì)胞因子的變化。通過(guò)觀察lncRNA uc.48+小干擾RNA在高糖高脂處理下RAW264.7巨噬細(xì)胞P2X7受體介導(dǎo)炎性變化中的作用，探討uc.48+小干擾RNA對(duì)P2X7受體介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)的作用及可能機(jī)制。
　　3、通過(guò)觀察uc.48+siRNA對(duì)2型糖尿病模型小鼠及其腹腔巨噬細(xì)胞病理變化的影響，探討uc.48+在2型

11、糖尿病小鼠及P2X7受體介導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞炎性損傷中的作用。
　　方法：
　　1、選取2型糖尿病CRP正常組、2型糖尿病CRP升高組、正常對(duì)照組3組人群；臨床血樣檢測(cè)項(xiàng)目包括空腹血糖(FPG)、餐后血糖（PPG）、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、糖化血清蛋白（GSP）、空腹胰島素(FPI)；收集受檢者的EDTA抗凝血并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞P2X7受體的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)

12、分析比較上述數(shù)據(jù)在3組人群中的差異。通過(guò)MTS檢測(cè)方法確定THP-1源性巨噬細(xì)胞的高糖高脂處理濃度；P2X7受體小干擾RNA(siRNA)干擾高糖高脂處理下的THP-1源性巨噬細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法和蛋白印跡方法分別檢測(cè)P2X7受體mRNA和蛋白的表達(dá)；通過(guò)熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧及鈣濃度；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的含量，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-10(IL-1

13、0)、白介素-1β(IL-1β)；蛋白印跡法檢測(cè)ERK信號(hào)通路的改變。
　　2、采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定2型糖尿病CRP正常組、2型糖尿病CRP升高組、正常對(duì)照組3組人群血清細(xì)胞因子的含量，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)血清中uc.48+的表達(dá)；Uc.48+小干擾RNA(siRNA)干擾高糖高脂處理下的RAW264.7細(xì)胞，通過(guò)R

14、T-PCR方法檢測(cè)uc.48+的表達(dá)、P2X7受體mRNA的表達(dá)；蛋白印跡法檢測(cè)P2X7受體蛋白及ERK信號(hào)通路的改變。通過(guò)熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧及鈣濃度；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的含量，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)；通過(guò)MTS試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞凋亡水平。
　　3、高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿

15、病小鼠模型，血糖檢測(cè)確定2型糖尿病小鼠模型是否成功建模；uc.48+小干擾RNA腹腔皮下注射后，檢測(cè)小鼠血清中的血脂和細(xì)胞因子濃度，檢測(cè)小鼠的血壓和心率、機(jī)械痛敏閾值和熱痛敏閾值；獲取并鑒定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，通過(guò)calcein-AM和YO-PRO染料檢測(cè)P2X7受體通道的形成；通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)uc.48+的表達(dá)、P2X7受體mRNA的表達(dá)；蛋白印跡法檢測(cè)P2X7受體蛋白及ERK信號(hào)通路的改變。
　　結(jié)果：
　　1、

16、2型糖尿病組在空腹血糖、餐后血糖、糖化血清蛋白、穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)及甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白均明顯高于正常對(duì)照組，而2型糖尿病CRP升高組在CRP、空腹胰島素、穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)及糖化血清蛋白均明顯高于其他2組。2型糖尿病CRP升高組單核細(xì)胞P2X7受體的表達(dá)明顯高于2型糖尿病CRP正常組和正常對(duì)照組。通過(guò)MTS試驗(yàn)確定高糖高脂處理THP-1巨噬細(xì)胞的濃度為44.4mM葡萄糖合并1.0mM游離脂肪酸；高糖高脂處理后

17、THP-1巨噬細(xì)胞P2X7受體的mRNA及蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加；P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著抑制P2X7 mRNA及蛋白的表達(dá)。P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧及鈣濃度；P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的THP-1巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β含量，P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著提高因高糖高脂處理而降低的IL-10濃度；P2X7 siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖

18、高脂處理而升高的THP-1巨噬細(xì)胞p-ERK1/2的蛋白激活水平。
　　2、2型糖尿病患者的TNF-α、IL-1β的水平明顯高于正常對(duì)照組，同時(shí)TNF-α及IL-1β的水平在2型糖尿病CRP升高組明顯高于2型糖尿病CRP正常組；IL-10在2型糖尿病CRP升高組的水平顯著低于其他2組。2型糖尿病患者血清uc.48+的表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著增加，uc.48+在2型糖尿病CRP升高組的表達(dá)明顯高于2型糖尿病CRP正常組。uc.48+

19、siRNA處理降低了高糖高脂誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞uc.48+的表達(dá)；uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的RAW264.7細(xì)胞P2X7受體mRNA和蛋白的表達(dá)。uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著提高因高糖高脂處理而降低的RAW264.7細(xì)胞增殖水平，uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的RAW264.7細(xì)胞凋亡水平。uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的RAW264.7細(xì)胞

20、內(nèi)活性氧及鈣濃度。uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β含量，uc.48+siRNA轉(zhuǎn)染可顯著提高因高糖高脂處理而降低的IL-10濃度；uc.48+ siRNA轉(zhuǎn)染可顯著降低因高糖高脂處理而升高的 RAW264.7細(xì)胞p-ERK1/2的蛋白激活水平。
　　3、高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型，小鼠空腹血糖及餐后血糖均較對(duì)照組顯著升高，提示2

21、型糖尿病模型制作成功；給予uc.48+siRNA注射后其空腹血糖及餐后血糖均較模型組顯著下降。模型組、小干擾對(duì)照組及uc.48+小干擾組的血脂較對(duì)照組顯著增加，但模型組、小干擾對(duì)照組及uc.48+小干擾組之間血脂比較無(wú)顯著性差異；模型組小鼠較對(duì)照組的機(jī)械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值均明顯降低，給予uc.48+siRNA注射后，其機(jī)械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值均較模型組反射閾值顯著增加；模型組的小鼠心率較對(duì)照組顯著增加，但給予uc.48

22、+siRNA注射后，模型組、干擾對(duì)照組及uc.48+小干擾組之間心率比較無(wú)顯著性差異；模型組的小鼠收縮壓及舒張壓均較對(duì)照組顯著增加，給予uc.48+siRNA注射后，其收縮壓及舒張壓均較模型組顯著下降；模型組TNF-α、IL-1β的含量較正常組顯著增加，而uc.48+siRNA注射后，其TNF-α、IL-1β的濃度顯著下降；模型組IL-10濃度較正常組明顯降低，而uc.48+siRNA注射后，其IL-10濃度顯著升高。模型組小鼠腹腔巨噬

23、細(xì)胞P2X7受體離子通道的形成、P2X7的mRNA及蛋白表達(dá)及p-ERK1/2的蛋白激活水平均明顯高于對(duì)照組；而uc.48+siRNA注射后可顯著降低P2X7受體離子通道的形成、P2X7的mRNA及蛋白表達(dá)及p-ERK1/2的蛋白激活水平。
　　結(jié)論：
　　1、2型糖尿病CRP升高組外周血單核細(xì)胞的P2X7受體的表達(dá)升高可能與胰島素抵抗的形成有關(guān)。高糖高脂作用THP-1源性巨噬細(xì)胞，其P2X7受體的表達(dá)、炎癥因子的釋放及p-

24、ERK信號(hào)通路的激活均可出現(xiàn)上調(diào)，而降低P2X7受體的表達(dá)，可抑制或改善其介導(dǎo)的炎癥狀態(tài)，揭示P2X7受體可調(diào)控THP-1源性巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
　　2、2型糖尿病CRP升高組患者處于免疫炎癥狀態(tài)，其血清uc.48+的表達(dá)、CRP含量及炎癥因子水平增加。高糖高脂刺激RAW264.7細(xì)胞uc.48+表達(dá)增加，并可導(dǎo)致多種途徑（如分泌細(xì)胞因子、產(chǎn)生活性氧、激活ERK信號(hào)通路等）功能異常，而uc.48+小干擾RNA可降低RAW264.

25、7細(xì)胞P2X7受體的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而影響P2X7受體介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)。
　　3、2型糖尿病小鼠腹腔巨噬細(xì)胞uc.48+的表達(dá)增加，uc.48+小干擾RNA影響2型糖尿病小鼠血糖血壓及神經(jīng)病理變化，降低2型糖尿病小鼠腹腔巨噬細(xì)胞P2X7受體的上調(diào)表達(dá)，并對(duì)2型糖尿病小鼠腹腔巨噬細(xì)胞P2X7受體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及ERK信號(hào)通路具有調(diào)控作用，提示uc.48+通過(guò)下調(diào)P2X7受體表達(dá)影響2型糖尿病小鼠血糖血壓、神經(jīng)病理變化及腹