皮膚及瘢痕成纖維細(xì)胞中神經(jīng)生長因子p75受體與sortilin的表達(dá).pdf

1、背景:手術(shù)、創(chuàng)傷、燒傷后常常形成增生性瘢（手術(shù)發(fā)生率40-90％，燒傷發(fā)生率31％-94％），增生性瘢痕會引起功能障礙、美容損害、瘙癢疼痛等諸多問題，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。如何減少瘢痕形成一直是燒傷、整形外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 創(chuàng)傷修復(fù)受多種因素的調(diào)節(jié)，其中神經(jīng)因素在創(chuàng)傷修復(fù)過程的作用日益受到重視。我們對燒傷創(chuàng)面愈合過程中的神經(jīng)再支配(reinnervation)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)傷后至瘢痕增生期神經(jīng)數(shù)目逐漸增多。激光共聚焦顯

2、微鏡下可以看到此期神經(jīng)纖維粗大，有明顯的折痕和局部破損，且分布混亂，而成熟期瘢痕神經(jīng)纖維趨于規(guī)律。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，燒傷后創(chuàng)面愈合及瘢痕增生過程中，神經(jīng)容積分?jǐn)?shù)與膠原容積分?jǐn)?shù)的變化具有相關(guān)性。國內(nèi)程飆等多名學(xué)者發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)SP、神經(jīng)生長因子等神經(jīng)活性肽對燒傷創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用。這說明神經(jīng)與組織修復(fù)、組織重塑具有密切的關(guān)系，增生期瘢痕神經(jīng)容積分?jǐn)?shù)NVF增高、神經(jīng)腫脹、扭曲提示愈合過程中傷區(qū)神經(jīng)的物理數(shù)目或神經(jīng)物質(zhì)合成增加，這提示此時(shí)神經(jīng)功能可

3、能出現(xiàn)相應(yīng)的變化。因此，此時(shí)神經(jīng)肽、神經(jīng)營養(yǎng)素等物質(zhì)的研究顯得尤為必要。
　　 神經(jīng)元、神經(jīng)支配的靶組織或膠質(zhì)細(xì)胞可以合成分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)，NTF包括神經(jīng)生長因子(NGF）、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5(NT-4/5)、神經(jīng)營養(yǎng)素-6(NT6)、神經(jīng)營養(yǎng)素-7(NT-7)等。NGF是最典型的神經(jīng)營養(yǎng)因子。NGF有兩種受體，高親和力受體TrkA，低親和力受體p75。成纖

4、維細(xì)胞是最主要的創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞。正常情況下皮膚成纖維細(xì)胞能分泌NGF，并表達(dá)p75/TrkA兩種受體。在多種損傷組織及修復(fù)組織中NGF及其特異性受體(TrkA，P75)都改變。NGF的功能因激活p75和或TrkA而異。單純激活p75或激活p75與其他生長因子受體(sortilin或Nogoreceptor)形成的復(fù)合體，可以通過JNK-p53-Bax通路引起細(xì)胞的凋亡或者生長抑制。激活TrkA則可通過激活NF-κB通路促進(jìn)細(xì)胞成活和分化，

5、在p75協(xié)助下這一作用將增強(qiáng)。
　　 與其他分泌性蛋白類似，NGF首先以其前體(proNGF)的形式合成，然后在各種蛋白酶的作用下裂解為成熟NGF(mNGF)。原來認(rèn)為proNGF沒有生物作用，近來研究發(fā)現(xiàn)proNGF可以與p75NTR高親和力結(jié)合引起細(xì)胞凋亡。當(dāng)存在輔助受體sortilin時(shí)，proNGF與p75NTR的親和力增加。新近發(fā)現(xiàn)ProNGF可以通過激活p75NTR-sortilin復(fù)合體引起NK細(xì)胞的死亡，起到抑制

6、自然免疫的作用。
　　 近來發(fā)現(xiàn)，NGF在多種組織中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用比較突出。在肝纖維化研究中發(fā)現(xiàn)體外應(yīng)用NGF可特異性地誘發(fā)肝星形細(xì)胞HSC的凋亡。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化初期MMP-7裂解pro-NGF，使得pro-NGF/mNGF平衡變化，促進(jìn)纖維化，p75介導(dǎo)的信號途徑可通過調(diào)節(jié)HSC的凋亡對纖維產(chǎn)生影響。①目前尚未查見同時(shí)研究NGF低親和力受體(p75NGFR)及其輔助受體sortilin在正常皮膚及瘢痕瘢痕組織內(nèi)

7、表達(dá)水平及其水平的報(bào)道。
　　 目的:研究神經(jīng)生長因子低親和力受體p75及soritilin在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KF)及正常皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)的中的表達(dá)情況，并分析p75及sortilin在正常皮膚成纖維細(xì)胞及瘢痕成纖維細(xì)胞中表達(dá)差異，探討p75及sortilin與瘢痕的發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。
　　 方法:收集正常皮膚及瘢痕疙瘩組織，以酶消化法體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞及正常皮膚成纖維細(xì)胞，結(jié)合組織來源并以免疫熒光法

8、鑒定細(xì)胞種類。選擇人永生化上皮細(xì)胞HaCaT為陽性對照，分析p75及sortilin在皮膚及瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。首先通過免疫組織化學(xué)分析p75及sortilin在瘢痕及皮膚組織中的表達(dá)并以realtimePCR在mRNA水平檢測p75及sortilin在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞及正常皮膚成纖維細(xì)胞的表達(dá)及差異，進(jìn)一步通過Western-blot及細(xì)胞免疫化學(xué)觀察p75NTR及sortilin在蛋白水平的表達(dá)及差異。
　　 結(jié)果:通

9、過酶消化法所取瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)良好原代，培養(yǎng)的人皮膚及瘢痕成纖維細(xì)胞接種3-5h就開始貼壁，2～3d時(shí)細(xì)胞開始生長繁殖，7-9d后繁殖旺盛，相互融合成片。倒置鏡下見細(xì)胞大多呈長梭形、扁平星形，部分呈三角形，而瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞在形態(tài)上無明顯區(qū)別。免疫熒光示免疫熒光染色顯示:培養(yǎng)的細(xì)胞胞核呈藍(lán)色，卵圓形（圖2），胞質(zhì)呈綠色熒光，Vimentin表達(dá)陽性，對照片無陽性產(chǎn)物。Realtime-PCR結(jié)果可見p75及sorti

10、lin在mRNA水平在KF及HSF表達(dá)均陽性，其中KF及HSF中p75及sortilin在mRNA水平表達(dá)量明顯少于HaCaT，且p75在KF及HSF中表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，sortilinmRNA的表達(dá)在KF中明顯低于HSF的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過westernblot進(jìn)一步從蛋白水平明確了p75及sortilin在KF及HSF中的表達(dá)及差異。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示p75及sortilin在兩種細(xì)胞中的表達(dá)部位均位于胞膜及胞漿。由于p