糖調(diào)控載脂蛋白A5基因的表達(dá).pdf

1、第一章糖對(duì)肝癌原代細(xì)胞載脂蛋白A5表達(dá)的影響
　　目的：明確D-葡萄糖及其類似物是否影響載脂蛋白A5(apolipoprotein A5，apoA5)表達(dá)，并探討糖及其類似物影響apoA5表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.不同濃度的D-葡萄糖(5mM，10mM，15mM，20mM，25mM)干預(yù)人肝癌原代細(xì)胞48h，及25mM D-葡萄糖干預(yù)人肝癌原代細(xì)胞不同時(shí)間(6h，12h，24h，48h)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量

2、PCR(real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)及蛋白免疫印跡法(western blotting，WB)測(cè)定apoA5表達(dá)。
　　2.不同濃度的D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-甘露醇(5mM，25mM)干預(yù)人肝癌原代細(xì)胞48h，采用Real-time PCR及WB測(cè)定apoA5表達(dá)。
　　3.不同濃度的D-葡萄糖(5mM，25mM)干預(yù)小鼠肝癌原代細(xì)胞(24

3、h，48h)后，采用Real-time PCR及WB測(cè)定apoA5表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.D-葡萄糖可呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性增加入肝癌原代細(xì)胞apoA5 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05)。
　　2.D-葡萄糖類似物增加入肝癌原代細(xì)胞apoA5 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05)。
　　3.D-葡萄糖可呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性增加小鼠肝癌原代細(xì)胞apoA5 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05)。
　　結(jié)

4、論：
　　1.D-葡萄糖及其類似物與apoA5表達(dá)水平密切相關(guān)，隨D-葡萄糖及其類似物濃度增加，apoA5表達(dá)增加。
　　2.D-葡萄糖及其類似物介導(dǎo)apoA5表達(dá)上調(diào)，這種調(diào)控機(jī)制可能涉及糖酵解途徑。
　　第二章轉(zhuǎn)錄因子USF1/2對(duì)載脂蛋白A5基因表達(dá)調(diào)控的研究
　　目的：探討轉(zhuǎn)錄因子USF1和USF2對(duì)載脂蛋白A5基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.不同濃度的D-葡萄糖(5mM

5、，25mM)干預(yù)人肝癌原代細(xì)胞48h后，采用Real-timePCR及WB測(cè)定USF1和USF2表達(dá)。
　　2.不同濃度的D-葡萄糖(5mM，25mM)干預(yù)人肝癌原代細(xì)胞48h后，采用染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecitation，ChIP)技術(shù)，確定USF1和USF2與apoA5啟動(dòng)子的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　1.D-葡萄糖不改變USF1和USF2的mRNA與蛋白在人肝癌原代細(xì)胞中的表達(dá)水

6、平(P>0.05)。
　　2.染色體免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)D-葡萄糖能增加轉(zhuǎn)錄因子USF1/USF2與人apoA5啟動(dòng)子的結(jié)合(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　在人肝癌原代細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子USF1/2可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)apoA5表達(dá)，此調(diào)節(jié)作用是通過轉(zhuǎn)錄因子USF1/2與apoA5啟動(dòng)子區(qū)域的E盒結(jié)合并激活其啟動(dòng)子活性。
　　第三章 Real-time PCR檢測(cè)人載脂蛋白A5基因的方法學(xué)建立及初步應(yīng)用
　　目的：

7、采用TaqMan-MGB探針技術(shù)建立一種檢測(cè)人載脂蛋白A5基因的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)新方法。
　　方法：
　　1.以重組克隆質(zhì)粒pPCR-Script-apoA5為模板，確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR的最佳循環(huán)參數(shù)(反應(yīng)條件)及反應(yīng)體系，建立最優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)(包括重復(fù)性、特異性、線性范圍等)。
　　2.將建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法用于2型糖尿病患者及健康體檢者全血標(biāo)本的檢測(cè)，以

8、驗(yàn)證該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1.以重組克隆質(zhì)粒為模板，確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR的最佳反應(yīng)條件(循環(huán)參數(shù))為：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃30sec(40cycles)。
　　2.20μl最適反應(yīng)體系為：Mg2+濃度2.5mM、引物濃度1.0μM、探針濃度1.0μM、dNTP250μM、10×buffer3μl、Taq DNA聚合酶1.0U、DNA模板2.0μl。
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