人CXCR4轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建與單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、CXCR4(CDl84)分子屬趨化因子家族，人CXCR4基因由由Feng等人于1996年發(fā)現(xiàn)并命名為Fusin,后來又被稱為LESTR或HUMSTR，人CXCR4基因位于染色體2q21區(qū)，編碼由352個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是高度保守的7次跨膜受體。CXCR4通過與其唯一的配體SDF一1Q構(gòu)成SDF．1α／CXCR4反應(yīng)軸而發(fā)揮生物學(xué)功能。CXCR4分子具有廣泛的表達譜，主要表達在外周血的CD2610wCD45RA+CD45RO-T淋巴細

2、胞，B淋巴細胞，樹突狀細胞，內(nèi)皮細胞和巨核細胞表面。CXCR4分子在免疫細胞、造血細胞的遷移和歸巢中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，而且參予神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、血管發(fā)生、組織損傷修復(fù)和再生等。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)大多腫瘤細胞也表達CXCR4，且腫瘤細胞表達CXCR4與其向組織侵潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨著CXCR4分子的生物學(xué)功能和信號傳導(dǎo)的分子機制的進一步研究，使其成為一個理想的生物干預(yù)靶分子，針對CXCR4分子的阻斷劑將有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。因此，CXCR4

3、轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建、CXCR4分子拮抗劑的研制及其在SDF。1Q／CXCR4信號傳導(dǎo)中的阻斷作用的研究將為腫瘤的治療提供有力的途徑。 1.人CXCR4基因的克隆及轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建 本研究通過RT-PCR方法，從人外周血單個核細胞(PBMC)的總RNA中擴增出編碼人CXCR4全長的cDNA片段，通過基因克隆技術(shù)，將其插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term。進一步采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達載體與輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細胞293

4、T，用其培養(yǎng)上清感染L929細胞72h后，經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達CXCR4分子的L929細胞株(L929／CXCR4)。經(jīng)體外長期傳代和液氮反復(fù)凍存和復(fù)蘇，轉(zhuǎn)基因細胞生長良好，并穩(wěn)定表達CXCR4。構(gòu)建的L929／CXCR4轉(zhuǎn)基因細胞能在SDF．1Q作用下介導(dǎo)遷移。 2．分泌鼠抗人CXCR4單抗的雜交瘤細胞株的制備 利用上述構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細胞L929／CXCR4為免疫原，免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴細胞融合技術(shù)，

5、將反復(fù)免疫后的小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2／0進行細胞融合，以此轉(zhuǎn)基因細胞作為陽性篩選細胞，以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對照細胞L929／mock作為陰性對照細胞，通過間接免疫熒光標(biāo)記法對雜交瘤細胞株進行篩選，并經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得l株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CXCR4單克隆抗體的雜交瘤細胞株32F7。經(jīng)快速定性試紙法分析鑒定，32F7的重鏈為Ig2a；輕鏈為K。經(jīng)體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長良好，穩(wěn)定分泌抗體。細胞

6、染色體的核型分析表明所得到的細胞株是一個雜交瘤細胞株。 進而采用本室建立的腹水誘生和純化方案，腹水形成陽性率為95％以上，腹水的產(chǎn)量平均約為5．Omi／只小鼠。經(jīng)ProteinG親和層析柱分離純化，腹水型單抗純化后蛋白含量在2mg／ml左右。純化后單抗的效價為1：1000以上，抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為1．O~2．0pg／l×106細胞。 3．鼠抗人CXCR4單克隆抗體的體外生物學(xué)特性研究 以L929／

7、CXCR4為競爭靶細胞，經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記的競爭抑制試驗，結(jié)果顯示，32F7與商品化的抗體12G5識別CXCR4分子的抗原位點完全不同。另外，經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記顯示，32F7能特異性識別T細胞，B細胞，NK細胞，DC，以及許多腫瘤細胞表面的CXCR4分子。且免疫組織化學(xué)實驗表明32F7可以識別一些組織表達的CXCR4分子。經(jīng)過板孔遷移實驗發(fā)現(xiàn)，所制備得到的抗人32F7抗體能較好的阻斷SDF-1Q／CXCR4軸在T細胞和腫瘤細胞遷移中的作

8、用，由此表明32F7單抗是有阻斷SDF-1Q／CXCR4相互作用的阻斷性單克隆抗體。本實驗還發(fā)現(xiàn)32F7單抗在阻斷SDF-1Q／CXCR4信號后可阻滯Raii細胞進入生長增殖周期，從而抑制了B淋巴瘤細胞的體外增殖，而且隨著抗體濃度的增加該效果更為明顯。 綜上所述，本研究成功克隆了人CXCR4基因、構(gòu)建了轉(zhuǎn)CXCR4的轉(zhuǎn)基因細胞并研制了l株能穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CXCR4功能性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，為深入探討SDF．1Q／CX