拉伸應(yīng)變對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：成骨細(xì)胞被認(rèn)為是力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中對(duì)應(yīng)力應(yīng)變信號(hào)進(jìn)行感知的主要力學(xué)敏感性細(xì)胞，但體外培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)力（應(yīng)變）水平和細(xì)胞反應(yīng)程度間的關(guān)系及細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制還不是十分清楚。本文以生物力學(xué)為基礎(chǔ)，采用四點(diǎn)彎曲拉伸裝置，研究不同時(shí)間和周期的拉伸應(yīng)變對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.研究運(yùn)用四點(diǎn)彎曲拉伸裝置對(duì)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞分別施加頻率為0.5Hz，不同強(qiáng)度(2500μ

2、ε、5000με)，不同時(shí)間(1min、3min、5min、10min)的拉伸應(yīng)變，另設(shè)0με(control group)做為對(duì)照組，采用熒光分光光度法檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，探討拉伸應(yīng)變對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響。
　　 2.分別給MC3T3-E1細(xì)胞施加2500με、5000με，頻率為0.5Hz，1次/d、1h/次，連續(xù)拉伸3d，同時(shí)設(shè)有加入鈣離子抑制劑維拉帕米組(Verapamil)及U73122

3、組，另設(shè)0με做為對(duì)照組，采用熒光分光光度法檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，分析不同應(yīng)力下[Ca2+]i、CaM的變化；采用Western-blot技術(shù)檢測(cè)CaMKⅡβ、CREB、p-CREB的蛋白表達(dá)，探討力學(xué)載荷對(duì)Ca2+-CaM-CaMKⅡβ-CREB信號(hào)通路的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.拉伸應(yīng)變對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞[Ca2+]i的影響。熒光分光光度法結(jié)果顯示：給MC3T3-E1細(xì)胞施加2500με，頻率為0.

4、5Hz，拉伸1min、3min、5min，其[Ca2+]i與對(duì)照組(161.00±13.23)相比顯著升高(p＜0.01)，其中3min組拉伸(306.00±5.57)達(dá)最高值；當(dāng)MC3T3-E1細(xì)胞施加5000με，頻率為0.5Hz，拉伸1min(290.67±18.34)其[Ca2+]i即達(dá)到峰值(p＜0.01)，與對(duì)照組相比1min、3min、5min、10min拉伸[Ca2+]i均顯著升高（p＜0.05）。
　　 2.拉

5、伸應(yīng)變對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞CaM活性的影響。結(jié)果顯示：MC3T3-E1細(xì)胞分別施加2500με、5000με，頻率為0.5Hz，拉伸時(shí)間和周期為1次/d，每次1h，連續(xù)3d，2500μe作用下CaM活性(345.67±80.525)較對(duì)照組(234.67±54.42)相比顯著升高(p＜0.05），給予鈣通道阻滯劑Verapamil及磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122后，CaM活性與2500με組相比均顯著下調(diào)(p＜0.01);5

6、000με作用下與對(duì)照組相比活性升高但沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）；給予Verapamil及U73122后，CaM活性與5000με組相比均顯著下調(diào)(p＜0.01)。
　　 3.拉伸應(yīng)變對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞CaMKⅡβ蛋白表達(dá)的影響。Western-blot結(jié)果顯示：MC3T3-E1細(xì)胞施加2500με，頻率及拉伸周期同前，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)(1.1120±0.2112)較對(duì)照組(0.8552±0.1488)相比顯著升

7、高（p＜0.05），加入Verapamil和U73122，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（p＜0.05)；當(dāng)細(xì)胞施加5000με時(shí)，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)(0.5870±0.1548)與對(duì)照組相比顯著降低(p＜0.05），加入Verapamil，U73122，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.01)。
　　 4.拉伸應(yīng)變對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞CREB和p-CREB蛋白表達(dá)影響結(jié)果顯示：細(xì)胞施加2500με、5000με時(shí)，

8、CREB蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；加入抑制劑Verapamil和U73122后，2500με、5000με組CREB蛋白表達(dá)仍無(wú)顯著變化（p＞0.05）。p-CREB蛋白表達(dá)在相同拉伸頻率、拉伸時(shí)間2500με組(6.6529土1.2615)蛋白表達(dá)量最高，與對(duì)照組(3.8407±1.5157)比較具有顯著差異(p＜0.01)，與加入抑制劑Verapamil(p＜0.01)和U73122(p＜0.05)組比較

9、抑制劑組蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)；相同條件拉伸5000με與加入抑制劑組比較，抑制劑組蛋白表達(dá)也顯著下調(diào)（p＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.拉伸應(yīng)變可以引起成骨細(xì)胞[Ca2+]i改變，不同時(shí)間的拉伸應(yīng)力(1min、3min、5min)均可以顯著升高[Ca2+]i，2500με組3min出現(xiàn)峰值，而5000με組1min出現(xiàn)峰值，5000με組[Ca2+]i達(dá)到峰值的時(shí)間早于2500με組。分析認(rèn)為在細(xì)胞受到超生理范圍拉

10、伸應(yīng)力時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出一種應(yīng)激狀態(tài)，在這種狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)和控制鈣離子內(nèi)流的膜控通道共同作用提升[Ca2+]i以此來(lái)應(yīng)對(duì)突然改變的外環(huán)境，而生理范圍拉伸只需細(xì)胞作出正常的應(yīng)答即可。
　　 改變拉伸頻率和周期后，生理性拉伸刺激可以增強(qiáng)CaM活性，超生理范圍拉伸可以減弱CaM的活性，加入鈣離子阻滯劑后CaM活性與未加入阻滯劑組相比，CaM活性下調(diào)。CaM是細(xì)胞內(nèi)主要的鈣結(jié)合蛋白，本研究結(jié)果說(shuō)明：力學(xué)信號(hào)在成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)

11、的轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]j和CaM活性具相關(guān)性。
　　 2.MC3T3-E1細(xì)胞施加2500με，頻率為0.5Hz，拉伸時(shí)間和周期為1次/d，每次1h，連續(xù)3d時(shí)，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，分別加入Verapamil、U73122拉伸2500με、5000με組，蛋白表達(dá)均顯著性下降。說(shuō)明：CaMKⅡβ參與了力學(xué)信號(hào)在成骨細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 3.CREB是細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，只有被磷酸化后才能進(jìn)行下一級(jí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

12、實(shí)施拉伸應(yīng)變后細(xì)胞內(nèi)p-CREB變化有顯著性差異，2500με組蛋白表達(dá)顯著升高，其結(jié)果與CaM和CaMKⅡβ的結(jié)果完全相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為在拉伸應(yīng)變作用于成骨細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+/CaM/CaMKⅡβ/p-CREB一系列連鎖的反應(yīng)，通過(guò)這一過(guò)程力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號(hào)傳達(dá)到細(xì)胞內(nèi)。
　　 4.本研究證實(shí)成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞受到拉伸刺激，其力學(xué)信號(hào)是通過(guò)Ca2+-CaM-CaMK-CREB信號(hào)途徑轉(zhuǎn)化為生物學(xué)效應(yīng)的。