基底拉伸應(yīng)變對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞生物力學(xué)效應(yīng)的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的：本文以生物力學(xué)為基礎(chǔ)，采用基底拉伸應(yīng)變裝置，研究不同時間和周期的基底拉伸應(yīng)變對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞生理活性和力學(xué)效應(yīng)的影響。探討不同應(yīng)變條件對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性、BMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，并尋找差異性生物標(biāo)志蛋白。
　　 方法：
　　 1.選用小鼠MC3T3-E1細(xì)胞，依據(jù)拉伸周期，隨機(jī)分為6組：A組，1次/d組；B組，2次/d組；C組，1次/d，2d組；D組，2次/d，2d組；E組，

2、1次/d，3d組；F組，2次/d，3d組；其中每組另設(shè)拉伸時間0.5h、1h、1.5h、2h。實(shí)驗(yàn)中工作應(yīng)變?yōu)?000μ∈，頻率為0.5Hz。采用MTT法，測定細(xì)胞增殖活性，選擇最佳拉伸時間。根據(jù)上述結(jié)果，設(shè)拉伸時間和周期為1次/d，每次1h，連續(xù)3d，頻率為0.5Hz；工作應(yīng)變?yōu)?000μ∈、1500μ∈、2000μ∈、2500μ∈和5000μ∈，對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞施加基底拉伸應(yīng)變，通過MTT法和紫外分光光度法，研究不同拉伸應(yīng)

3、變對細(xì)胞增殖活性和上清液中堿性磷酸酶（ALP）含量的影響。
　　 2.采用RT-PCR和Western-blot技術(shù)，研究工作應(yīng)變?yōu)?μ∈、1000μ∈、1500μ∈、2000μ∈、2500μ∈和5000μ∈，頻率為0.5Hz，拉伸時間為1次/d，每次1h，連續(xù)3d對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 3.拉伸時間和頻率不變，采用雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DE），分析工作應(yīng)變?yōu)?μ∈、2

4、500μ∈、5000μ∈對細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的鑒定：通過HE、ALP染色和成骨細(xì)胞表面標(biāo)志物-骨鈣素（BGP）免疫組化證實(shí)，小鼠MC3T3-E1具有成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　 2.基底拉伸應(yīng)變裝置的力學(xué)評價：基底拉伸應(yīng)變裝置應(yīng)變的大小，可以通過CD段的等彎矩區(qū)控制，對體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞施加定量均勻應(yīng)變，并可用電阻應(yīng)變計和應(yīng)變儀監(jiān)測。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)中，

5、該裝置完全能滿足對細(xì)胞施加各種應(yīng)變的要求。
　　 3.基底拉伸應(yīng)變對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性和ALP含量的影響：（1）不同拉伸時間對細(xì)胞增殖活性的影響，MTT結(jié)果證實(shí)：A、B、C、D、E、F各周期應(yīng)變組中，每組拉伸0.5h、1h細(xì)胞增殖活性呈上升趨勢，拉伸1.5h、2h細(xì)胞增殖活性呈下降趨勢。其中C組（0.234±0.030）和F組（0.338±0.026）拉伸1h與各自對照組（0.192±0.047）和（0.290±0

6、.055）相比，細(xì)胞增殖活性顯著增高；E組（0.313±0.039）拉伸1h與對照組（0.265±0.038）相比，細(xì)胞增殖活性顯著增高。（2）不同拉伸應(yīng)變對細(xì)胞增殖活性影響的結(jié)果顯示：與0μ∈組（0.279±0.056）相比，1000μ∈（0.323±0.060）組和1500μ∈組（0.330±0.042）沒有統(tǒng)計學(xué)意義；2000μ∈組（0.346±0.059）和2500μ∈組（0.373±0.062）顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖；5000μ∈組

7、（0.213±0.019）顯著抑制細(xì)胞增殖。（3）不同拉伸應(yīng)變對細(xì)胞ALP含量的影響，結(jié)果顯示：與0μ∈組（1.589±0.184）相比，2000μ∈組（2.069±0.143）和2500μ∈組（2.218±0.119）ALP的含量顯著增高；5000μ∈組（1.392±0.206）ALP的含量顯著降低，ALP含量結(jié)果與細(xì)胞增殖結(jié)果一致。
　　 4.基底拉伸應(yīng)變對小鼠MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響：RT-

8、PCR結(jié)果顯示：與0μ∈組（0.5386±0.028）相比，1000μ∈組（0.5620±0.020）和1500μ∈組（0.6228±0.012）BMP-2 mRNA表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)意義；2000μ∈組（0.7813±0.010）和2500μ∈組（0.8121±0.013）BMP-2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)；5000μ∈組（0.3878±0.003）BMP-2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。Western-blot結(jié)果顯示：與0μ∈組（0.3217

9、±0.010）相比，2000μ∈組（0.3539±0.006）和2500μ∈組（0.3673±0.010）細(xì)胞BMP-2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)；5000μ∈組（0.3044±0.007）細(xì)胞BMP-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。
　　 5.蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：0μ∈平均檢測到（549±11）個蛋白點(diǎn)，2500μ∈作用下平均檢測到（563±14）個蛋白點(diǎn)；5000μ∈作用下平均檢測到（574±14）個蛋白點(diǎn)。與0μ∈組相比，2500μ∈發(fā)現(xiàn)

10、14種差異蛋白的表達(dá)，其中2種蛋白在應(yīng)變作用后降低，12種蛋白在應(yīng)變作用后增高；5000μ∈發(fā)現(xiàn)9種差異蛋白的表達(dá)，其中2種蛋白在應(yīng)變作用后降低，7種蛋白在應(yīng)變作用后增高。
　　 結(jié)論：
　　 1.基底拉伸可以影響小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性，且增殖活性的高低與拉伸時間有關(guān)。生理范圍內(nèi)小于2000μ∈的基底拉伸，不影響細(xì)胞的增殖活性和ALP的分泌；生理范圍內(nèi)較高強(qiáng)度2000μ∈和2500μ∈基底拉伸可以明顯促進(jìn)細(xì)胞

11、的增殖活性和ALP的分泌；超生理范圍5000μ∈基底拉伸可抑制細(xì)胞的增殖和ALP的分泌。
　　 2.生理范圍內(nèi)2000μ∈、2500μ∈拉伸應(yīng)變上調(diào)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)，5000μ∈下調(diào)細(xì)胞BMP-2mRNA和蛋白表達(dá)。基底拉伸應(yīng)變可能是通過改變細(xì)胞中BMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)，而影響細(xì)胞的增殖和ALP分泌。
　　 3.基底拉伸可導(dǎo)致小鼠MC3T3-E1細(xì)胞蛋白質(zhì)組發(fā)生變化。相同時間