氟鋁聯(lián)合染毒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、目的：
　　 氟是人體所必需的微量元素,對(duì)人體健康具有雙重作用,適量的氟是人體必需的,是構(gòu)成骨骼和牙齒的重要成分,并且能夠促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和生殖功能。長(zhǎng)期大量攝入氟可引起氟中毒,主要表現(xiàn)為氟斑牙和氟骨癥。鋁是地球上含量最豐富的一種金屬,低劑量的鋁可刺激骨細(xì)胞的增殖和分化,而人體長(zhǎng)期攝入鋁,在體內(nèi)蓄積后會(huì)引起神經(jīng)退行性疾病、骨軟化和貧血等鋁中毒性疾病。研究表明,Al+和F-結(jié)合能力比其它60多種金屬離子都要強(qiáng),在酸堿度呈中性條件下,氟

2、化物可與鋁離子形成氟化鋁,主要形成AlF3和AlF-4,AlFx是G蛋白激活因子,與多種酶的激活有關(guān)。在氟病區(qū),鋁廠、鋁礦工人在日常生產(chǎn)活動(dòng)中,除了接觸大量的鋁以外,同時(shí)還暴露于高氟環(huán)境。飲水型氟中毒病區(qū)采用鋁鹽除氟,也造成當(dāng)?shù)仫嬘盟蟹X共存現(xiàn)象。很多速食食品中也都同時(shí)檢出氟、鋁含量超標(biāo)。茶樹(shù)有強(qiáng)烈富集氟、鋁元素的性質(zhì),樹(shù)體內(nèi)的氟、鋁主要富集于成熟葉與老葉中,可高達(dá)1,175mg/kg和4,381mg/kg,因此往往導(dǎo)致成熟葉和老葉加

3、工的磚茶中氟、鋁含量嚴(yán)重超標(biāo),造成飲茶性氟中毒。既往流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)氟能促進(jìn)鋁在骨骼中蓄積,鋁能加重氟中毒的危害,因此飲茶性氟中毒病區(qū)的人群骨相損害往往比較嚴(yán)重。所以研究氟鋁聯(lián)合的作用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義與科研價(jià)值。
　　 成骨細(xì)胞由骨內(nèi)膜和骨外膜深層以及骨髓的骨祖細(xì)胞分化而成。在膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨中,充質(zhì)細(xì)胞(MSCs)分化為成骨細(xì)胞同時(shí)分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),隨著ECM的鈣化,成骨細(xì)胞被包埋在骨質(zhì)中成為骨細(xì)胞。其

4、發(fā)育和分化可簡(jiǎn)括為如下幾個(gè)階段:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell)→祖細(xì)胞(progenitor cell)→前成骨細(xì)胞(preosteoblast)→成熟成骨細(xì)胞(mature osteoblast)→骨細(xì)胞(osteocyte)。
　　 小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E1 Subclone 14),是從小鼠的顱頂骨細(xì)胞建株的前成骨細(xì)胞系,具有ALP活性、Ⅰ型膠原酶合成能力和基質(zhì)鈣化等成骨細(xì)胞

5、典型的生物學(xué)活性。本研究利用MC3T3-E1細(xì)胞系研究不同劑量氟、鋁和氟鋁聯(lián)合染毒后對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和分化能力的影響,并探討氟鋁聯(lián)合染毒后對(duì)核心結(jié)合因子-α1(Runx2)、Osterix、骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG)、細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)的影響,為進(jìn)一步闡明地方性氟中毒骨相損害機(jī)制的研

6、究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 小鼠顱頂骨前成骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E subclone 14)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于α-MEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清,1×105U/L青、鏈霉素),5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)。
　　 2、配制染毒液
　　 配制100mM NaF和10mM AlCl3的儲(chǔ)備液。在染毒前稀釋為工作液,分別為500μM和50 μM

7、,為最終染毒劑量的10倍。聯(lián)合染毒液根據(jù)Chabre的方法[14],以NaF 1mM與AlCl3100 mM 1:1混合,現(xiàn)用現(xiàn)配。
　　 3、細(xì)胞增殖活力能力檢測(cè)
　　 采用CCK法。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組、單純?nèi)痉M、單純?nèi)句X組和氟鋁聯(lián)合染毒組。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔的光密度(OD)值。每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)平行樣。
　　 4、細(xì)胞周期檢測(cè)
　　 采用細(xì)胞周期試劑盒檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照

8、組、單純?nèi)痉M、單純?nèi)句X組和氟鋁聯(lián)合染毒組。用FAC Scan流式細(xì)胞儀,488 nm處檢測(cè)紅色熒光
　　 5、ALP活性測(cè)定
　　 本實(shí)驗(yàn)ALP活性的測(cè)定采用ALP test kit。細(xì)胞ALP活性的測(cè)定根據(jù)以下原理:磷酸對(duì)硝基苯酚在ALP存在時(shí),能轉(zhuǎn)化為對(duì)硝基苯酚和磷酸鹽。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組、單純?nèi)痉M、單純?nèi)句X組和氟鋁聯(lián)合染毒組。
　　 6、細(xì)胞總RNA的提取
　　 采用常規(guī)RNA提取法,以Triz

9、ol來(lái)提取MC3T3-E1細(xì)胞中的RNA。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組、單純?nèi)痉M、單純?nèi)句X組和氟鋁聯(lián)合染毒組。
　　 7、引物合成
　　 從GenBank下載其cDNA序列,根據(jù)文獻(xiàn)和專(zhuān)用設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的mRNA引物；檢索小鼠看家基因(β-actin)、OPG、RANKL、Osterix、Runx2cDNA序列,由上海生工生物公司設(shè)計(jì)并合成。
　　 8、RT-PCR
　　 取細(xì)胞總RNA

10、3μl,檢測(cè)RNA濃度。用前調(diào)整濃度至0.5μg/μl。RT總反應(yīng)體積為5μl。PCR總反應(yīng)體積為20μl,具體步驟如下:cDNA 5μl,5×PCR Buffer 5μl,上下游引物(10μM)各0.25μl,Taq酶0.125μl,補(bǔ)水14.375μl,混勻于0.5 ml EP管中。
　　 二、統(tǒng)計(jì)分析
　　 用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組與組之間用兩組獨(dú)立樣本t-test；組間比較采用單因素方差分析(

11、ANOVA)。
　　 結(jié) 果
　　 1、MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)觀察
　　 未貼壁的MC3T3-E1細(xì)胞呈圓形,經(jīng)培養(yǎng)24 h后,在倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞呈三角形、紡錘形和多角形等多種形態(tài)。形態(tài)相似的細(xì)胞成堆出現(xiàn),胞漿伸展,并伸出2～4個(gè)突起,細(xì)胞核明顯,核仁清晰(見(jiàn)圖1)。3～4 d,細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng),細(xì)胞體積增大,胞漿豐富。6～7 d,細(xì)胞融合呈鋪石狀排列(見(jiàn)圖2)。
　　 2、氟對(duì)MC3T

12、3-E1細(xì)胞增殖能力的影響
　　 由表1可見(jiàn),10-9～10-4 M F-作用24～72 h后對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞無(wú)促進(jìn)增殖作用,1 mM F-顯著抑制MC3T3-E1細(xì)胞增殖(p<0.01)。
　　 3、氟、鋁及氟鋁聯(lián)合對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響
　　 由表2可見(jiàn),與對(duì)照組相比,氟(50μM)或鋁(5μM)染毒72 h后對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞無(wú)促進(jìn)增殖作用；氟鋁聯(lián)合染毒(F 50μM+Al 5μM)顯著

13、促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖(p<0.01)。與對(duì)照組相比,氟鋁聯(lián)合作用后,增殖率增加了9.2％。
　　 4、氟、鋁及氟鋁聯(lián)合對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞周期的影響
　　 從表3可以看出,與對(duì)照組相比,氟(50μM)、鋁(5μM)對(duì)細(xì)胞周期影響不明顯；而氟鋁聯(lián)合染毒72 h后,G2/M期細(xì)胞顯著增多(p<0.05),PI以及DNA相對(duì)含量顯著增高(p<0.05)。
　　 5、氟、鋁及氟鋁聯(lián)合對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞AL

14、P活性的影響
　　 由表4可以看出,對(duì)照組相比,氟(50μM)或鋁(5μM)礦化液染毒5 d后,MC3T3-E1細(xì)胞ALP表達(dá)量無(wú)明顯變化；氟鋁聯(lián)合染毒(F 50μM+Al 5μM)顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的ALP表達(dá)(p<0.05),刺激MC3T3-E1細(xì)胞分化。
　　 6、RT-PCR結(jié)果
　　 6.1染毒72h氟、鋁及氟鋁聯(lián)合對(duì)Runx2、Osterix mRNA表達(dá)的影響
　　 從圖7、8可以

15、看出,染毒72 h后,與對(duì)照組相比,單純?nèi)痉M(50μM)或單純?nèi)句X組(5μM)Runx2、Osterix mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化；氟鋁聯(lián)合染毒組(F 50μM+Al 5μM)顯著促進(jìn)Runx2 mRNA的表達(dá)(p<0.05)；氟鋁聯(lián)合染毒組(F 50μM+Al5μM)Osterix mRNA表達(dá)顯著增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。
　　 6.2染毒72h氟、鋁及氟鋁聯(lián)合對(duì)OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響
　　

16、 從圖10、11、12可以看出,染毒72 h后,與對(duì)照組相比,單純?nèi)痉M(50μM)或單純?nèi)句X組(5μM)OPG mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化；氟鋁聯(lián)合染毒組(F 50μM+Al5μM)顯著促進(jìn)OPG mRNA的表達(dá)(p<0.05)。各組的RANKL mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異。與對(duì)照組相比,氟鋁聯(lián)合染毒組(F 50μM+Al 5μM)RANKL/OPG比值降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　 結(jié) 論
　　 1、氟鋁聯(lián)合

17、能夠顯著提高對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖,并且能顯著提高M(jìn)期細(xì)胞的含量,促進(jìn)成骨細(xì)胞由S期向M期轉(zhuǎn)化,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。
　　 2、氟鋁聯(lián)合能增加MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。
　　 3、氟鋁聯(lián)合能夠顯著提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞Runx2、Osterix mRNA的表達(dá)量,促進(jìn)成骨細(xì)胞形成。氟鋁聯(lián)合能夠顯著促進(jìn)OPG mRNA的表達(dá),下調(diào)RANKL/OPG比值,使骨重建失衡,從而起到抑制骨吸收、促進(jìn)骨