拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:骨細(xì)胞作為骨組織中機(jī)械應(yīng)力的直接感受器，對維持骨組織的正常功能非常重要。但是應(yīng)力作用下骨細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制還不是十分清楚。本文擬研究不同周期和不同時間的拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細(xì)胞Ca2+及其信號通路的影響，進(jìn)而探討拉伸應(yīng)力對骨細(xì)胞的部分作用機(jī)制。為進(jìn)一步研究骨重建機(jī)制提供科學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、研究選用小鼠骨細(xì)胞系MLO-Y4細(xì)胞作為研究對象，采用四點(diǎn)彎曲拉伸裝置對小鼠骨細(xì)胞分別施加應(yīng)力

2、為:2500με、5000με，頻率為0.5Hz，時間:1次/d、1h/次、連續(xù)拉伸3d。同時設(shè)有加入鈣離子抑制劑維拉帕米組(Verapamil)及U73122組，另設(shè)0με做為對照組。實(shí)驗(yàn)分為:0με(control group)、2500με、5000με、V+2500με、V+5000με、U73122+2500με、U73122+5000με七組。采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性，探討拉伸應(yīng)變對MLO-Y4細(xì)胞增殖活性的影響。

3、r>　　 2、研究選用小鼠骨細(xì)胞系MLO-Y4細(xì)胞作為研究對象，采用四點(diǎn)彎曲拉伸裝置對小鼠骨細(xì)胞分別施加頻率為0.5Hz，應(yīng)力分別為:2500με、5000με，不同時間(1min、3 min、5 min、10 min)的拉伸應(yīng)變，另設(shè)0με(controlgroup)做為對照組，采用熒光分光光度法檢測各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，探討基底拉伸應(yīng)變對細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響。
　　 3、給MLO-Y4細(xì)胞施加頻率0

4、.5Hz，應(yīng)力分別為:2500με、5000με，實(shí)驗(yàn)分為:0με(control group)、2500με、5000με、V+2500με、V+5000με、U73122+2500με、U73122+5000με七組，采用熒光標(biāo)記技術(shù)觀察2500με、5000με作用下CaM在MLO-Y4細(xì)胞的表達(dá);采用熒光分光光度法檢測各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，檢測不同應(yīng)力下CaM的變化;采用Western-blot技術(shù)檢測CaMKⅡβ、CREB、p

5、-CREB的蛋白表達(dá)，探討拉伸應(yīng)力對Ca2+-CaM-CaMKⅡβ-CREB信號通路的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示:給MLO-Y4細(xì)胞施加2500με，頻率為0.5Hz，時間:1次/d、1h/次、連續(xù)拉伸3d，細(xì)胞增殖活性與對照組相比顯著增加(p＜0.01);施加5000με，時間與頻率不變，細(xì)胞增殖活性與對照組相比顯著降低(p＜0.05)。
　　 2、拉伸應(yīng)

6、變對小鼠MLO-Y4細(xì)胞[Ca2+]i的影響。研究結(jié)果證實(shí):給MLO-Y4細(xì)胞施加2500με，頻率為0.5Hz，拉伸時間分別為:1min、3min、5min，各組[Ca2+]i與對照組(454.5175±31.3695)相比顯著升高(p＜0.01)，其中5min組拉伸(566.8609±26.3508)達(dá)最高值;當(dāng)MLO-Y4細(xì)胞施加5000με，頻率為0.5Hz，拉伸3min(253.2509±30.0641)其[Ca2+]i與對照

7、組相比顯著降低(p＜0.01)，1min、3min、5min、10min各組與對照組相比[Ca2+]i均呈下降趨勢，其變化趨勢與2500με相似，均在作用3min、10min時處于低點(diǎn)。
　　 3、拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細(xì)胞CaM表達(dá)及活性的影響。結(jié)果顯示:MLO-Y4細(xì)胞有CaM的表達(dá);給MLO-Y4細(xì)胞分別施加2500με、5000με，頻率為0.5Hz，拉伸時間和周期為1次/d，每次1h，連續(xù)3d，2500με作用下C

8、aM活性(399.3518±27.1691)較對照組(237.9961±20.0063)相比顯著升高(p＜0.01)，給予鈣通道阻滯劑Verapamil及磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122后，CaM活性與2500με組相比均顯著下調(diào)(p＜0.01);5000με作用下與對照組相比CaM活性顯著下降p＜0.05）;給予Verapamil及U73122后， CaM活性與5000με組相比均顯著下調(diào)(p＜0.01)。
　　 4、拉伸

9、應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細(xì)胞CaMKⅡβ蛋白表達(dá)的影響。Western-blot結(jié)果顯示:MLO-Y4細(xì)胞施加2500με，頻率及拉伸周期同前，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)(13.7039±0.6881)較對照組(9.0573±0.4183)相比顯著升高(p＜0.01)，加入Verapamil和U73122，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)均下調(diào)(p＜0.01);當(dāng)細(xì)胞施加5000με時，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)(10.6232±0.6119)與對照組相比顯著降

10、低(p＜0.05），加入Verapamil，U73122，CaMKⅡβ蛋白與未加入拮抗劑組相比，表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)(p＜0.01)。
　　 5、拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細(xì)胞CREB和p-CREB蛋白表達(dá)影響結(jié)果顯示:細(xì)胞施加2500με、5000με時， CREB蛋白表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05）;加入抑制劑Verapamil和U73122后，2500με、5000με組CREB蛋白表達(dá)仍無顯著變化(p＞0.05

11、）。相同拉伸頻率、拉伸時間、2500με組(19.9547±1.5397) p-CREB蛋白表達(dá)與對照組(15.2538±1.1189)相比較顯著升高(p＜0.01)，加入抑制劑Verapamil(p＜0.01)和U73122(p＜0.05)較2500με組p-CREB蛋白表達(dá)均進(jìn)一步下調(diào);相同條件拉伸5000με與加入抑制劑組比較，抑制劑組蛋白表達(dá)也顯著下調(diào)(p＜0.05）。
　　 結(jié)論:本研究從細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i、CaM、

12、CaMK、CREB四個環(huán)節(jié)系統(tǒng)研究了拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)拉伸應(yīng)變可以通過[Ca2+]i-CaM-CaMK-pCREB信號通路調(diào)控小鼠骨細(xì)胞的增殖。
　　 1、通過MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí):生理載荷的拉伸應(yīng)變可以促進(jìn)骨細(xì)胞增殖，超生理載荷拉伸應(yīng)變可以抑制骨細(xì)胞增殖，細(xì)胞內(nèi)鈣及外鈣均參與此過程。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)證實(shí):向骨細(xì)胞分別施以0.5Hz，2500με、5000με拉伸應(yīng)力，作用1min、

13、3 min、5min、10min時均發(fā)生相應(yīng)的變化，但變化趨勢不同;當(dāng)細(xì)胞施加頻率為0.5Hz、2500με作用1min、5min時[Ca2+]i呈上升趨勢，5min時[Ca2+]i達(dá)到最高，3min、10min呈下降趨勢，施加5000με0.5Hz作用1 min、3min、5min、10min[Ca2+]i均下降，3min達(dá)到最低點(diǎn)。
　　 3、生理載荷的拉伸應(yīng)變可以促進(jìn)CaM活性增強(qiáng)，超生理載荷拉伸應(yīng)變可以抑制CaM活性，內(nèi)