嗜水氣單胞菌J-1株luxS基因缺失株的構(gòu)建及特性分析.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是重要的水生病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失，同時還是重要的人畜共患病病原菌。該菌的致病性與其產(chǎn)生的毒力因子密切相關(guān)，已知毒力因子有胞外酶、溶血素、腸毒素以及粘附素如菌毛和表面蛋白S層等。這些毒力因子相互協(xié)同作用于機體，發(fā)揮毒性作用。此過程受到嚴格的調(diào)控，群體感應系統(tǒng)參與此調(diào)控過程。
　　 群體感應（Quorum Sensing，QS）即細菌在生長過程中通過一定

2、的信號分子來傳遞信息，使細胞能感知周圍環(huán)境中自己同類的數(shù)量，并據(jù)此調(diào)節(jié)自身基因的表達，產(chǎn)生特定的行為。群體感應細菌產(chǎn)生、釋放、響應的信號分子命名為自體誘導物（Autoinducer，AI）。本試驗根據(jù)已發(fā)表的嗜水氣單胞菌QS相關(guān)基因序列設(shè)計引物，以J-1株基因組為模板，PCR擴增分別得到AI-1合成酶基因ahyI；AI-2合成酶基因luxS、轉(zhuǎn)錄結(jié)合蛋白ahyR基因核苷酸序列。測序分析發(fā)現(xiàn)，擴增出的3段基因與已測出全基因組的嗜水氣單胞菌

3、ATCC7966的同源性較高。用根瘤農(nóng)桿菌JZA1（Agrobacterium tumefaciens）檢測AI-1；哈維氏弧菌BBl70（Vibrio harveyi）檢測AI-2，結(jié)果均能測出信號，說明嗜水氣單胞菌可能存在雙組分QS信號傳導系統(tǒng)。
　　 AI-1對嗜水氣單胞菌毒力因子的調(diào)控已有報道，而luxS為嗜水氣單胞菌ATCC7966株全基因組測序發(fā)現(xiàn)的S-核糖高半胱氨酸（SRH）裂解酶同源基因，該酶在其他細菌中被證實參

4、與催化合成 AI-2。對于luxS基因在嗜水氣單胞菌中的功能，以及它在QS中扮演何種角色還知之甚少。本試驗構(gòu)建了luxS基因缺失株，為下一步分析奠定基礎(chǔ)。根據(jù)ATCC7966的全基因組序列設(shè)計合成兩對引物，分別擴出luxS基因上下游1000bp左右的序列。選擇合適的酶切位點，在上下游片段中間插入氯霉素抗性基因，構(gòu)建缺失luxS的自殺性質(zhì)粒pHM5（luxS）。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli SM10，接合法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入嗜水氣單胞菌J-1株，在含

5、有氯霉素、頭孢唑啉的培養(yǎng)基上篩選單交換插入株。PCR驗證后單交換菌株接入無NaCl、含20％蔗糖的LB液體培養(yǎng)基中，倍比稀釋后涂濃度20％蔗糖的LB平板，PCR鑒定雙交換缺失株。
　　 luxS基因缺失后發(fā)現(xiàn)，細菌生長較野生株慢。AI-1產(chǎn)生第一個波峰提前，第二個波峰升高，說明luxS缺失也會影響信號分子1的合成，這暗示了QS系統(tǒng)1和QS系統(tǒng)2協(xié)同調(diào)控的功能。缺失luxS后細菌幾乎不產(chǎn)生AI-2，這確證了LuxS的AI-2合成酶

6、功能。不管是缺失株還是野生株，在血平板和脫脂奶平板上均能產(chǎn)生透明圈，說明缺失株產(chǎn)生溶血素和胞外蛋白酶的能力沒有丟失。隨后的RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，缺失株在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期溶血素基因表達沒有顯著變化，而絲氨酸蛋白酶基因在對數(shù)生長期表達較高，在穩(wěn)定期顯著降低。這與QS系統(tǒng)1調(diào)控胞外蛋白酶方式一致。全菌蛋白SDS-PAGE比較發(fā)現(xiàn)，缺失株中一個明顯的蛋白條帶丟失；而上清蛋白SDS-PAGE沒有發(fā)現(xiàn)蛋白條帶明顯的改變。小鼠攻毒試驗