豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株特有基因mmuM缺失株構(gòu)建及特性分析.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis, SS）是世界范圍內(nèi)存在的一種重要的人畜共患病原體。它可分為33個(gè)血清型(1/2，1-31，33)，目前針對(duì)血清2型（Streptococcus suis2，S.suis2，SS2）的研究最為深入。無(wú)論是在中國(guó)國(guó)內(nèi)、東南亞地區(qū)還是世界范圍內(nèi)，關(guān)于SS2的研究報(bào)道最多，因?yàn)槠渲虏⌒宰顝?qiáng)，感染案例最多。它可以引起豬的嚴(yán)重疾病，例如敗血癥，腦膜炎，關(guān)節(jié)炎和肺炎等，造成養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)

2、濟(jì)損失。在導(dǎo)致人類(lèi)的疾病當(dāng)中，腦膜炎是其最常見(jiàn)的表現(xiàn)型，此外它還可以引發(fā)其他全身并發(fā)癥如敗血癥，肺炎等。在我國(guó)曾經(jīng)爆發(fā)過(guò)兩次嚴(yán)重的豬鏈球菌感染人事件，并造成重大的人員傷亡。正是在這兩次爆發(fā)中，第一次觀察到由豬鏈球菌引起的中毒性休克綜合癥(streptococcal toxic shock syndrome，STSS)。同時(shí)，豬鏈球菌病在這兩次爆發(fā)中也體現(xiàn)出了深部組織感染和高侵襲率的臨床特征。與病毒不同，細(xì)菌基因組較大，基因組結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜

3、且構(gòu)成菌體的蛋白數(shù)量很多，所以為其致病機(jī)理的研究帶來(lái)了很多困難。雖然目前關(guān)于引起和促進(jìn)其發(fā)病的毒力因子的研究較多，但對(duì)于豬鏈球菌的致病機(jī)理仍舊沒(méi)有完全明確。所以，研究探索其致病菌株的毒力因子仍是當(dāng)今豬鏈球菌的研究熱點(diǎn)。
　　本研究同樣是圍繞著探尋和驗(yàn)證豬鏈球菌的毒力因子而展開(kāi)的。主要包括以下幾個(gè)方面:
　　1、豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株特有基因mmuM的鑒定
　　在之前的研究中通過(guò)內(nèi)標(biāo)化的斑馬魚(yú)模型對(duì)若干豬鏈球菌強(qiáng)弱毒株進(jìn)行篩

4、選。選取篩選到的7株弱毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序，并與NCBI上已經(jīng)公布的10株強(qiáng)毒株全基因組進(jìn)行泛基因組(pan-genome)分析。通過(guò)pan-genome分析，發(fā)現(xiàn)了53個(gè)在SS2強(qiáng)毒株中存在但是弱毒株中沒(méi)有的基因，推測(cè)這些SS2強(qiáng)毒株共同特有的基因是潛在的毒力因子。mmuM基因就是這53個(gè)基因之一，編碼同半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(homocystine methyltransferase，HMT)。對(duì)之前用斑馬魚(yú)模型篩選到的一些豬鏈球菌2型

5、強(qiáng)弱毒株以及豬鏈球菌其他血清型菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)mmuM基因只存在于豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株中。因此，我們推測(cè)mmuM基因與豬鏈球菌2型的致病性相關(guān)，是可能的毒力因子。
　　2、mmuM、 OppA和IMPDH的原核表達(dá)及重組蛋白對(duì)HEp-2細(xì)胞的黏附性分析
　　對(duì)豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株特有基因mmuM進(jìn)行了原核表達(dá)，同時(shí)對(duì)我們用2D far-western blot方法篩選出的15個(gè)層粘蛋白(laminin，LN)結(jié)合蛋白和5

6、個(gè)纖粘蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)結(jié)合蛋白中的兩個(gè)蛋白OppA(Oligopeptide-binding protein OppAprecursor，對(duì)LN和FN均有結(jié)合性，LN結(jié)合性為第一次發(fā)現(xiàn)）和IMPDH（Inosine5'-monophosphate dehydrogenase，有LN結(jié)合性，第一次發(fā)現(xiàn)有此特性）進(jìn)行了原核表達(dá)，并對(duì)它們的ECM結(jié)合性進(jìn)行了驗(yàn)證。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，以上三種原核表達(dá)得到的重組蛋白均對(duì)

7、人喉癌上皮細(xì)胞（HEp-2）有粘附性。這一結(jié)果也證明了用2D far-western blot篩選ECM結(jié)合蛋白從而確定潛在粘附因子這一思路和方法的可行性。
　　3、mmuM基因缺失株和互補(bǔ)株的構(gòu)建及它們的特性分析
　　為了驗(yàn)證mmuM是潛在毒力因子的推測(cè)，我們以豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株ZY05719為研究對(duì)象，采用經(jīng)典的同源重組方法，利用溫敏自殺性質(zhì)粒pSET4s成功構(gòu)建了mmuM基因的缺失株ΔmmuM，然后利用穿梭質(zhì)粒pSET

8、2成功構(gòu)建了互補(bǔ)株CΔmmuM?；镜纳飳W(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)ZY05719、ΔmmuM和CΔmmuM三者的生長(zhǎng)特性、溶血特性、革蘭氏染色特性及電鏡下的菌體形態(tài)相近。通過(guò)對(duì)本室保存的其他血清型的豬鏈球菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其他血清型中并不合有mmuM基因，這就進(jìn)一步提示mmuM基因只存在于豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株中;通過(guò)斑馬魚(yú)毒力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生株ZY05719，缺失株的毒力水平有所下降;細(xì)胞粘附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ΔmmuM缺失株對(duì)人喉癌上皮細(xì)胞（HE

9、p-2）的粘附能力顯著下降;全血存活試驗(yàn)(Whole blood survival assay)表明缺失株在豬抗凝全血中的存活率相對(duì)于野生株有較為明顯的下降;實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示已報(bào)道的公認(rèn)毒力因子sly2C、mrp和sly在缺失株ΔmmuM中的轉(zhuǎn)錄水平均有所下降。我們推測(cè)，mmuM基因可能也是豬鏈球菌2型的一個(gè)毒力因子。
　　4、ΔmmuM和ZY05719的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)野生株Z

10、Y05719、缺失株ΔmmuM全菌蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)了91個(gè)在缺失株中比在野生株中表達(dá)水平下調(diào)1.5倍的蛋白，66個(gè)在缺失株中表達(dá)水平比在野生株中表達(dá)水平上調(diào)1.5倍的蛋白，而且這些蛋白的表達(dá)水平差異顯著(P＜0.05)。在缺失株中表達(dá)下調(diào)的蛋白中，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)下調(diào)明顯的且已報(bào)道與細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的粘附性或者毒力相關(guān)的蛋白，包括3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAP