RegⅣ基因?qū)Y(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景：絕大多數(shù)結(jié)直腸癌系結(jié)直腸腺瘤惡變而來的，即所謂的腺瘤．腺癌進(jìn)程發(fā)展，所以獲得腺瘤差異表達(dá)基因?qū)ρ芯堪┰缙诎l(fā)生的機(jī)制尤為重要。RegIV基因是近幾年來發(fā)現(xiàn)的新的差異表達(dá)基因，它的表達(dá)較其他Reg家族基因更突出地表現(xiàn)在胃腸道；在正常結(jié)腸組織，結(jié)腸腺癌，胰腺癌，胃癌，前列腺癌中有不同水平的表達(dá)，尤其在結(jié)直腸腺瘤癌變區(qū)RegIV的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)特別明顯；而且高表達(dá)ReglV的結(jié)直腸癌細(xì)胞與耐藥及其分化表型密切相關(guān)。認(rèn)為Reg IV可能是

2、癌發(fā)生的早期生物標(biāo)記物，其表達(dá)上調(diào)可能與預(yù)后差有關(guān)。但目前所有文獻(xiàn)僅限于對(duì)RegIV在結(jié)直腸癌及其癌前病變(腺瘤、潰瘍性結(jié)腸炎)中的上調(diào)這一現(xiàn)象的描述，而對(duì)其影響結(jié)直腸癌細(xì)胞系生物學(xué)特性及其作用機(jī)制的研究還未見有文獻(xiàn)報(bào)道。 目的：觀察ReglV基因在四種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，研究ReglV陰性表達(dá)的LoVo細(xì)胞系經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RegIV基因后的表達(dá)水平改變，轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞系的增殖能力、侵襲力、c-myc基因表達(dá)的改變；觀

3、察轉(zhuǎn)染前后RegIV基因?qū)δ[瘤化療藥物(5-Fu)抑制LoVo細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及bcl-2基因表達(dá)的影響；同時(shí)觀察5-Fu對(duì)轉(zhuǎn)染后LoVo細(xì)胞的ReglV基因表達(dá)水平的影響，由此初步探討RegrV基因的生物學(xué)功能及其可能作用機(jī)制。 材料和方法： 1．用RT-PCR技術(shù)檢測四種結(jié)直腸癌細(xì)胞系的ReglV基因表達(dá)水平及pcDNA3.1-ReglV重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染與鑒定； 2．用MTT法檢測ReglV基因轉(zhuǎn)染

4、前后LoVo細(xì)胞的增殖活性及5-FU作用48h后的生長抑制率(IC50值)；用體外侵襲力實(shí)驗(yàn)測定ReglV基因轉(zhuǎn)染前后LOV0細(xì)胞的侵襲能力改變； 3．應(yīng)用流式細(xì)胞儀和瓊脂糖凝膠電泳方法分別測定5-FU作用48h后對(duì)ReglV基因轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞的凋亡水平； 4．用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞的癌基因c-myc表達(dá)、5-Fu干預(yù)48h后ReglV表達(dá)的水平以及凋亡抑制基因bcl-2的表達(dá)變化。 結(jié)果

5、： 1．LoVo細(xì)胞系幾乎不表達(dá)ReglV基因，HT-29、CaCo-2細(xì)胞系為高表達(dá)，Sw480細(xì)胞系表達(dá)較前兩者弱。 2．成功構(gòu)建含有ReglV基因的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-ReglV)，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)ReglV基因的LOV0(+)細(xì)胞。 3．ReglV基因轉(zhuǎn)染后LoV0(+)細(xì)胞增殖活性弱于轉(zhuǎn)染前LoVo細(xì)胞，有顯著性差異(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞的侵襲力比較無明顯差異；轉(zhuǎn)染后Lo

6、Vo(+)細(xì)胞在5-Fu干預(yù)48小時(shí)后ReglV表達(dá)無明顯改變。 4．ReglV基因轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細(xì)胞在5-Fu的濃度(0.391、0.782mg/L)時(shí)生長抑制率明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染前LoVo(-)細(xì)胞(P<0.01)，而在濃度大于3.125mg/L時(shí)轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細(xì)胞生長抑制率弱于轉(zhuǎn)染前LoVo(-)細(xì)胞(P<0．01)；轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細(xì)胞IC50值小于轉(zhuǎn)染前LoVo(-)細(xì)胞。 5．ReglV基因轉(zhuǎn)染前L

7、oVo(-)細(xì)胞c-myc基因表達(dá)呈陽性，而轉(zhuǎn)染后表達(dá)明顯下調(diào)；轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞bcl-2基因均呈陰性，5-FU(3.125mg/1)干預(yù)轉(zhuǎn)染前LoVo(一)細(xì)胞bcl-2基因呈弱表達(dá)而干預(yù)轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細(xì)胞bcl-2基因表達(dá)陽性。 6．在5-FU較高濃度(0.782、3.125mg/1)干預(yù)48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前LoVo(-)細(xì)胞的凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細(xì)胞，瓊脂糖凝膠電泳顯示轉(zhuǎn)染前Lo

8、Vo(-)細(xì)胞梯狀條帶比轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細(xì)胞條帶清晰。 結(jié)論： 1、明確了四種結(jié)直腸癌細(xì)胞系的ReglV表達(dá)水平及成功構(gòu)建轉(zhuǎn)染了pcDNA-ReglV； 2、ReglV基因轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細(xì)胞c-myc基因表達(dá)明顯下調(diào)，提示ReglV基因可能與c-myc基因相關(guān)： 3、ReglV基因?qū)D(zhuǎn)染前后LOV0(+)細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞侵襲力無明顯影響； 4、ReglV基因轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細(xì)胞在5