Indian hedgehog過表達對軟骨細胞生物學影響的實驗研究.pdf

1、目的：觀察ExGe.500介導的India.hedgeho.(pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh)過表達對體外培養(yǎng)的人胚軟骨細胞的生物學效應，并檢測重組基因Ihh-eGFP對Ihh的功能是否具有影響。 方法：1、通過基因克隆技術將Ihh目的基因構建入載體質(zhì)粒pSNAV2.0中，另外運用重疊PCR技術將增強綠色熒光蛋白構建入pSNAV-Ihh載體質(zhì)粒中。2、人胚軟骨細胞的分離，培養(yǎng)并通過免疫組織化學和透射電鏡觀察鑒定

2、。3、用ExGe.500將構建好的載體質(zhì)粒pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh分別轉染到培養(yǎng)的人胚軟骨細胞模型中，以pSNAV空質(zhì)粒為對照，通過繪制軟骨細胞增殖曲線，MTT測細胞增殖活力，半定量RT-PCR測轉染后軟骨細胞內(nèi)Ihh及其受體Ptc的mRNA的表達差異來研究Ihh對軟骨細胞的生物學效應。 結果：1、成功的構建了pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh兩種克隆質(zhì)粒，通過菌液PCR、測序檢驗所構建克隆

3、無突變。2、成功分離、培養(yǎng)人胚軟骨細胞，經(jīng)過特殊染色、免疫組化染色鑒定所培養(yǎng)的人胚軟骨細胞具有正常軟骨細胞的特性。透射電鏡觀察證明所培養(yǎng)的軟骨細胞具有正常軟骨細胞的超微結構。3、經(jīng)過綠色熒光顯微鏡檢測到ExGe.500介導的pSNAV-Ihh-eGFP在體外培養(yǎng)的人胚軟骨細胞內(nèi)表達，轉染效率約為35％。兩試驗組在細胞增殖、細胞活力及mRNA表達方面明顯高于對照組(p<0.05)，而兩實驗組之間無明顯差異(p>0.05)。 結論：