塞來昔布對食管癌組織中P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子甲基化狀態(tài)、mRNA表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:研究發(fā)現(xiàn)三種途徑可致抑癌基因失活。第一，基因內(nèi)突變，第二，染色體變異，第三啟動子區(qū)DNA甲基化。啟動子區(qū)DNA甲基化是一個化學(xué)修飾過程，中間由酶介導(dǎo)，屬表觀遺傳學(xué)范疇。從而一些研究發(fā)現(xiàn)，某些抑癌基因，如P14AR，DAP-K和TIMP-3等的表達(dá)和食管癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，基因啟動子區(qū)甲基化后導(dǎo)致抑癌基因失活，功能喪失，隨之患惡性腫瘤的幾率明顯增加。
　　 近年來，NSAIDS（非甾體類抗炎藥），例如阿司匹林，吲哚美辛

2、，塞來昔布等，可以降低患胃腸道腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)已成為腫瘤防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。流行病學(xué)研究顯示服用非甾體類抗炎藥能降低食管癌的死亡率。但是NSAIDS對食管癌甲基化的影響研究較少。本研究將觀察食管癌患者中P14ARF，DAP-K和TIMP-3等基因啟動子的甲基化情況與塞來昔布（選擇性抑制COX-2）對食管鱗癌P14ARF，DAP-K和TIMP-3等基因啟動子甲基化的影響。
　　 方法:
　　 1.研究標(biāo)本:選2012年6月至

3、2013年1月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸三科食管上皮鱗狀細(xì)胞癌患者13例，男性9例，女性4例，男女比例9∶4，平均年齡60.85歲，患者術(shù)前、術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌，均未行放化療，均未長期服用阿司匹林等非甾體類抗炎藥物，均無其他惡性腫瘤病史。實(shí)驗(yàn)組:患者服藥前行胃鏡檢查并進(jìn)行食管癌組織咬檢，后囑患者口服塞來昔布400mg/每次，2次/日，取術(shù)后大體病理標(biāo)本。對照組:選取19例食管鱗癌患者，術(shù)前均未服用非甾體抗炎藥，經(jīng)術(shù)前各項(xiàng)檢查后

4、行食管癌根治術(shù)，術(shù)后選取該患者新鮮手術(shù)食管鱗癌標(biāo)本。術(shù)前、術(shù)后取材時(shí)，標(biāo)本離體后立即浸泡于事先準(zhǔn)備好的later液中，并迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱貯存以備用。2將對照組與實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本進(jìn)行冰上研磨分別提取組織DNA與RNA，并置于-80℃冰箱保存以防降解。利用特異性甲基化PCR技術(shù)(MSP)對實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行甲基化檢測，計(jì)算甲基化率，利用RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)組中所測得P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子甲基化的同一個體前后mRNA

5、表達(dá)。3檢測實(shí)驗(yàn)組中服藥前后標(biāo)本的凋亡率。4利用SPSS軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。基因甲基化狀態(tài)與其臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系應(yīng)用x2檢驗(yàn);甲基化率采用Fisher確切概率法檢驗(yàn);mRNA的表達(dá)分析與凋亡率的比較采用配對t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。
　　 結(jié)果:
　　 1.P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子甲基化狀態(tài)及其與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系
　　 P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中

6、的甲基化率分別為38.4％、46.1％和30.8％。P14ARF基因啟動子甲基化狀態(tài)與患者的年齡、性別無關(guān)（P均＞0.05），與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(x2=5.468，P=0.019)有關(guān)。DAP-K基因甲基化狀態(tài)與患者的年齡、性別及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P均＞0.05)均無關(guān)。TIMP-3基因甲基化狀態(tài)與患者的年齡和性別無關(guān)(P均＞0.05)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(x2=5.468，P=0.019)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)組與對照組中P14AR

7、F、DAP-K和TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化情況
　　 實(shí)驗(yàn)組中服藥前P14ARF基因啟動子甲基化率為38.5％(5/13)，對照組中甲基化率為47.4％(9/19)，經(jīng)塞來昔布處理后的去甲基化率為60％(3/5)，對照組去甲基化率為0％(0/9)，經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)，x2=6.382，P=0.027＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組中服藥前DAP-K基因啟動子甲基化率為46.1％(6/13)，對照組中甲基化率為5

8、7.9％(11/19)，經(jīng)塞來昔布處理后的去甲基化率為50％(3/6)，對照組去甲基化率為0％(0/11)，經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)，x2=6.286，P=0.029＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組中服藥前TIMP-3基因啟動子甲基化率為30.8％(4/13)，對照組中甲基化率為36.8％(7/19)，經(jīng)塞來昔布處理后的去甲基化率為50％(2/4)，對照組去甲基化率為0％(0/9)，經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)，x2=3.889

9、，P=0.049＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.塞來昔布處理前后P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因mRNA表達(dá)量的比較
　　 經(jīng)塞來昔布處理后P14AR基因mRNA的相對灰度值為0.56±0.046，明顯高于經(jīng)塞來昔布處理前的相對灰度值0.37±0.051，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.290P=0.000)。經(jīng)塞來昔布處理后DAP-K基因mRNA的相對灰度值為0.53±0.117，明顯高于經(jīng)塞來昔布處

10、理前的相對灰度值0.37±0.051，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.455P=0.011)。經(jīng)塞來昔布處理后TIMP-3基因mRNA的相對灰度值為0.50±0.095，明顯高于經(jīng)塞來昔布處理前的相對灰度值0.38±0.049，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.600P=0.019)。
　　 4.經(jīng)塞來昔布處理前后細(xì)胞凋亡情況
　　 經(jīng)塞來昔布處理前食管癌組織總體凋亡率為12.32±6.46％，經(jīng)塞來昔布處理后食管癌組織總體凋亡率

11、為19.18±6.09％，經(jīng)配對t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)t=-11.507，P=0.000＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.塞來昔布可以降低P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化程度。
　　 2.塞來昔布可以提高P14ARF、DAP-K和TIMP-3基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)。
　　 3.DAP-K基因甲基化狀態(tài)與患者年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，P14ARF和TIMP-3基因與