維甲酸耐藥細胞與敏感細胞的差異蛋白質表達譜分析.pdf

1、目的：比較維甲酸耐藥細胞與敏感細胞的差異蛋白表達譜，分析、篩選維甲酸耐藥相關蛋白，以探討維甲酸的耐藥機制。 方法：1、提取維甲酸敏感細胞株NB4及維甲酸耐藥細胞株MR2的全蛋白，進行雙向凝膠電泳分離，經(jīng)PDQuestv7.1分析軟件篩選出差異表達的蛋白質點，質譜分析獲得差異蛋白質的肽質量指紋圖譜，以此通過Mascot軟件查詢SWISS-PROT蛋白數(shù)據(jù)庫、進行差異蛋白質的鑒定，獲得候選維甲酸耐藥相關蛋白。 2、采用wes

2、ternblotting及半定量RT-PCR在蛋白水平和mRNA水平對差異蛋白質進行驗證。 結果：1、獲得了分辨率高、重復性好的APL細胞的雙向電泳圖譜，維甲酸敏感細胞株NB4和維甲酸耐藥細胞株MR2的pI4-7雙向凝膠電泳圖譜顯示平均蛋白點分別為890±45和912±56。在二者間分析到57個差異蛋白點，23個蛋白在RA耐藥細胞株MR2中上調，34個蛋白下調。25個差異蛋白質點經(jīng)質譜鑒定，17個獲得成功鑒定，對應于13個ORF

3、，其中一個是未知功能的新蛋白FLJ00279，其余分屬于癌蛋白DJ-1、轉錄相關蛋白(MYCpromoterbindingprotein1)、分子伴侶(HSP70、HSP60及proteindisulfideisomerase)、代謝類蛋白(prohibitin、Triosephosphateisomerase1及calreticulin)和信號轉導(RhoGDPdissociationinhibitorbeta)以及細胞骨架蛋白(AC

4、TG1protein、Beta5-tubulin及keratin10)。 2、半定量RT-PCR顯示HSP70和HSP60的蛋白質表達差異與mRNA水平變化無相關一致性。westernblotting試驗展現(xiàn)了DJ-1和calreticulin在多個異構體上的差異表達。兩種實驗結果提示翻譯后蛋白的修飾或剪切介導了蛋白的表達差異。 3、酸化的DJ-1蛋白異構體可能參與維甲酸耐藥；不同質量的calreticulin可能在細胞

5、凋亡及分化兩條途徑干擾維甲酸作用；HSP70、HSP60、Prohibitin以及MYCpromoterbindingprotein1也可能從不同角度介導維甲酸耐藥產(chǎn)生。 結論：應用雙向凝膠電泳連接質譜的蛋白質組學方法篩選到新蛋白FLJ00279以及功能已知的DJ-1、calreticulin、HSP70、HSP60、Prohibitin及MYCpromoterbindingprotein1等維甲酸耐藥相關蛋白，雖然它們與維甲酸