伊馬替尼耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　慢性粒細(xì)胞性白血病(chronicmyelocyticleukemia,CML)是一種起源于多能造血干細(xì)胞的髓系惡性克隆增殖性腫瘤,費(fèi)城染色體(Philadelphiachromosome,Ph)的形成是其特征性標(biāo)志---由22號(hào)染色體長臂與9號(hào)染色體長臂相互易位構(gòu)成,即t(9,22)(q34;q11)。染色體的改變在分子水平上導(dǎo)致了Bcr/Abl融合基因的形成,其編碼的融合蛋白產(chǎn)物即P210Bcr-Abl蛋

2、白具有明顯的酪氨酸激酶(proteintyro-sinekinase,PTK)活性,通過直接或間接介導(dǎo)酪氨酸激酶的信號(hào)傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)基因表達(dá),使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,過度增殖和凋亡受阻,最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。
　　甲磺酸伊馬替尼(mesylateimatinib,STI571,Gleevec)是2-苯氨嘧啶的衍生物,作為第一個(gè)靶向治療人類腫瘤的小分子酪氨酸激酶抑制劑,其主要通過競爭性結(jié)合Abl酪氨酸激酶區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn),使得該激酶失去催化活性,

3、阻斷下游的信號(hào)傳導(dǎo),最終達(dá)到治療腫瘤的目的。該藥物自上市以來,在CML及胃腸間質(zhì)瘤的治療上獲得了良好的療效。但隨著應(yīng)用的不斷廣泛,越來越多耐藥病例的出現(xiàn)引起了國內(nèi)外專家學(xué)者的高度重視,并紛紛投入到伊馬替尼耐藥機(jī)制的研究中來。
　　目前研究發(fā)現(xiàn),伊馬替尼的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜且尚不完全明確,可能涉及多個(gè)基因、多個(gè)蛋白以及多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常。因此本課題從蛋白質(zhì)水平出發(fā),利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),通過雙向凝膠電泳分離及質(zhì)譜鑒定,比較伊馬替

4、尼耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜,進(jìn)而分析并篩選伊馬替尼耐藥相關(guān)蛋白,最終探討伊馬替尼的耐藥機(jī)制。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　本研究主要建立在蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(Two-dimensionalElectrophoresis,2-DE)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)(MassSpectrum,MS)的基礎(chǔ)上,通過對(duì)伊馬替尼耐藥細(xì)胞株(K562/R)和敏感細(xì)胞株(K562/S)采用2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS的技術(shù)路線進(jìn)行了蛋白

5、質(zhì)組學(xué)研究。
　　1、培養(yǎng)并收集伊馬替尼敏感細(xì)胞株及伊馬替尼耐藥細(xì)胞株,采用CCK-8比色法分別測定細(xì)胞生長抑制率并計(jì)算耐藥倍數(shù)。
　　2、提取兩組細(xì)胞總蛋白質(zhì),采取Bradford測定法繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算蛋白質(zhì)濃度;利用雙向電泳技術(shù)分離細(xì)胞總蛋白,并用ImageScannerⅡ透射掃描儀獲取雙向凝膠電泳圖譜;將圖譜輸入計(jì)算機(jī),借助ImageMaster2DElite5.0圖像分析軟件對(duì)比找出合適的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。

6、r>　　3、膠內(nèi)酶切差異蛋白質(zhì)點(diǎn)后,利用ABI4800TOF-TOF質(zhì)譜儀采取基質(zhì)輔助電離解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)模式對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,分別獲取肽質(zhì)量指紋圖(PMF)和肽序列標(biāo)簽圖(PSF);用MatrixScience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫,尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)并查詢其功能;最后結(jié)合差異蛋白質(zhì)點(diǎn)表觀等電點(diǎn)、匹配肽段、分子量和覆蓋率等進(jìn)行綜合分析,鑒定出相關(guān)蛋白質(zhì)。
　

7、　4、通過文獻(xiàn)檢索確定可能與伊馬替尼耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì),并采用westernblotting技術(shù)在蛋白水平對(duì)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1、通過CCK-8比色法測定K562/R的半數(shù)抑制濃度(IC50)為5.609427μmol/L,K562/S的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.979632μmol/L;耐藥倍數(shù)為5.726。
　　2、通過Bradford測定法測定K562/S所提取的總蛋白質(zhì)濃度定量為

8、6.416846492mg/ml,K562/R所提取的總蛋白質(zhì)濃度定量為6.6610472726mg/ml。
　　3、重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得了分辨率高、重復(fù)性好的K562細(xì)胞株的雙向凝膠電泳圖譜;經(jīng)ImageMaster2DElite5.0圖像分析軟件分析發(fā)現(xiàn),K562/S雙向凝膠電泳圖譜顯示平均蛋白點(diǎn)(1387±21)個(gè),K562/R雙向凝膠電泳圖譜顯示平均蛋白點(diǎn)(1154±16)個(gè);經(jīng)圖譜對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),兩組蛋白質(zhì)表達(dá)量差異大于兩倍以上的

9、共有20個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中有6個(gè)在K562/R高表達(dá),有14個(gè)在K562/S中高表達(dá)。
　　4、通過文獻(xiàn)檢索篩選出DJ-1蛋白和肌苷三磷酸焦磷酸酶(ITPA)可能與伊馬替尼耐藥相關(guān);采用westernblotting技術(shù)在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):DJ-1蛋白在兩組細(xì)胞中均有表達(dá)且耐藥株表達(dá)量高于敏感株,而ITPA在耐藥株中表達(dá)量明顯高于敏感株;兩者均與雙向電泳結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1、不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)技術(shù)并多次實(shí)驗(yàn),最終