骨髓增生異常綜合征(MDS)的流式診斷及表觀(guān)遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、上篇流式細(xì)胞術(shù)在鑒別診斷MDS和疾病特征及預(yù)后指示中的臨床應(yīng)用
　　第一章基于CD34+細(xì)胞免疫表型的低危MDS流式診斷積分系統(tǒng)的構(gòu)建及相關(guān)免疫表型模式的生物學(xué)意義探討
　　目的:研究低危骨髓增生異常綜合征(MDS)骨髓中CD34+原始細(xì)胞免疫表型模式以及在疾病診斷及預(yù)后中的意義。
　　材料與方法:采用CD45/SSC設(shè)門(mén)四色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)21例正常人和良性血液病(基準(zhǔn)組)、核型異常IPSS分類(lèi)低危MDS患者21例(陽(yáng)

2、性對(duì)照組)、核型正常IPSS分類(lèi)低危MDS患者45例(待檢組)和16例IPSS分類(lèi)高危MDS/MDS-AML患者CD34+原始細(xì)胞比例,以及下列抗原在CD34+細(xì)胞中的表達(dá)比例:CD117、CD133、CD11b、CD15、CD4、CD56;以良性血液病患者免疫表型表達(dá)(均數(shù)+2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)為基準(zhǔn),任一種抗原表達(dá)超過(guò)這個(gè)基準(zhǔn)值則定義為異?；蜿?yáng)性(評(píng)為1分),建立流式評(píng)分系統(tǒng)對(duì)MDS患者進(jìn)行評(píng)分。
　　結(jié)果:①基準(zhǔn)組流式評(píng)分0-2分和

3、3-7分的比例分別為100％(21/21)和0％(0/21);陽(yáng)性對(duì)照組患者流式評(píng)分0-2分和3-7分的比例分別為23.8％(5/21)、76.2％(16/21);核型正常低危MDS患者流式評(píng)分0-2分和3-7分的比例分別為22.2％(10/45)、77.8％(35/45);高危組流式評(píng)分為0-2分和3-7分的比例分別為25.0％(4/16)和75.0％(12/16);流式評(píng)分診斷核型正常MDS的靈敏度和特異性可達(dá)77.8％和100％。

4、②核型正常低危患者CD34+細(xì)胞超過(guò)基準(zhǔn)值者比例較低,且共表達(dá)CD117比例也低,主要表現(xiàn)為CD34+細(xì)胞共表達(dá)CD133、CD11b/CD15和CD4/CD56;而高危組病例CD34+細(xì)胞超過(guò)基準(zhǔn)值者比例明顯升高,共表達(dá)CD117/CD133超過(guò)基準(zhǔn)值者比例極高,但共表達(dá)髓系成熟抗原(CD11b/CD15)和淋系抗原(CD4/CD56)超過(guò)基準(zhǔn)值者比例極低。核型異常低危組情況介于上述兩組之間。③低危MDS患者CD11b和CD15以及C

5、D4和CD56在CD34+細(xì)胞中具有顯著的同步表達(dá),CD117和CD133在CD34+細(xì)胞中的表達(dá)比例不顯示同步表達(dá)。④低危MDS患者流式評(píng)分與IPSS積分顯示微弱正相關(guān);其中與外周血細(xì)胞減少系數(shù)顯示正相關(guān),與骨髓形態(tài)學(xué)原始細(xì)胞比例明顯反相關(guān),與核型預(yù)后(好/中/差)無(wú)明顯相關(guān)。⑤骨髓低增生和HLA-DR15陽(yáng)性患者通常獲得較高的流式評(píng)分(4分或更高)。⑥在本積分系統(tǒng)中,獲得高流式積分的MDS患者總生存優(yōu)于低流式積分患者。
　　結(jié)

6、論:①由CD34+原始細(xì)胞相關(guān)免疫表型構(gòu)建的流式評(píng)分在輔助診斷無(wú)染色體異常/無(wú)環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多/無(wú)原始細(xì)胞增多的低危MDS上顯示良好的敏感性和特異性。②本系統(tǒng)中核型正常的低危MDS→核型異常的低危MDS→高危MDS/MDS-AML,不同的CD34+原始細(xì)胞比例及其免疫表型表達(dá)模式可能體現(xiàn)了疾病的克隆性演化。③低危MDS的免疫發(fā)病因素可能是該流式系統(tǒng)的病理基礎(chǔ)。
　　第二章改進(jìn)的MDS流式診斷積分系統(tǒng)的建立與鞏固及其臨床意義分析<

7、br>　　目的:通過(guò)納入新的具有特定意義的免疫表型,構(gòu)建一個(gè)改進(jìn)的通用型MDS流式診斷積分系統(tǒng),評(píng)估其在各類(lèi)MDS亞型中的診斷價(jià)值,并探討分析該流式積分系統(tǒng)的臨床意義。
　　材料與方法:診斷列和鞏固列雙列設(shè)計(jì):診斷列包括檢測(cè)45例對(duì)照組患者(良性血液病)和99例MDS組患者(核型正常WHO分類(lèi)低危MDS50例,核型異常低危MDS23例,高危MDS26例),鞏固列包括28例良性血液病患者和20例MDS患者。采用CD45/SSC設(shè)門(mén)四

8、色流式細(xì)胞術(shù)CD34+原始細(xì)胞比例,以及下列抗原在CD34+細(xì)胞中的表達(dá)比例:CD38、CD19、CD117、CD7、CD11b、CD15、CD4、CD56;以對(duì)照組免疫表型表達(dá)為基準(zhǔn)(均數(shù)加或減2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)或通過(guò)受試者工作特征曲線(xiàn)(ROC曲線(xiàn))來(lái)計(jì)算基準(zhǔn)值,任一種抗原表達(dá)低于或超過(guò)這個(gè)基準(zhǔn)值則定義為異?；蜿?yáng)性,其中CD34+細(xì)胞比例評(píng)分按照以下規(guī)則:2.5％、5-10％和＞10％分別評(píng)為1分、2分和3分,CD19或CD38表達(dá)低于基準(zhǔn)

9、值評(píng)為1分,CD117、CD7、CD11b、CD15、CD4或CD56表達(dá)超過(guò)基準(zhǔn)值評(píng)為1分,各項(xiàng)評(píng)分累積為MDS患者的流式總分。
　　結(jié)果:①基準(zhǔn)對(duì)照組流式評(píng)分0-3分和4-7分的比例分別為100％(21/21)和0％(0/21),MDS組患者流式評(píng)分0-3分和3-7分的比例分別為18.2％(5/21)和81.8％(16/21)。流式評(píng)分診斷MDS的靈敏度和特異性可達(dá)81.8％和100％。②鞏固分析顯示該系統(tǒng)診斷鞏固組MDS的敏

10、感性和特異性達(dá)到85.0％和92.9％,與診斷組敏感性和特異性相符;診斷正確率(流式診斷與臨床/形態(tài)診斷相符率)可達(dá)89.6％。③核型正常低危MDS患者CD34+細(xì)胞高表達(dá)淋系和成熟髓系抗原CD4、CD56、CD15和CD11b,而核型異常MDS患者CD34+細(xì)胞高表達(dá)干祖細(xì)胞分化及增殖抗原CD34、CD38、CD19、CD117和CD7,核型異常低危MDS上述抗原表達(dá)介于二者之間。④來(lái)自于CD4、CD56、CD15和CD11b異常表達(dá)

11、的流式積分定義為早期積分,而來(lái)自于CD34、CD38、CD19、CD117和CD7異常表達(dá)的積分定義為進(jìn)展積分:低危MDS獲得高的早期積分,高危MDS獲得高的進(jìn)展積分;早期積分和進(jìn)展積分相互拮抗;低增生MDS獲得高的早期積分,高增生MDS獲得高的進(jìn)展積分。⑤流式總積分和進(jìn)展積分與WHO分類(lèi)和IPSS預(yù)后分類(lèi)呈正相關(guān),而早期積分與IPSS預(yù)后分類(lèi)呈反相關(guān);⑥流式總積分與MDS患者是否存在輸血依賴(lài)無(wú)關(guān)聯(lián);高的流式總積分和進(jìn)展積分預(yù)示著MDS

12、患者較差的生存,相反的是,早期積分卻是MDS患者預(yù)后好的一個(gè)標(biāo)志;此外,同時(shí)具有高的早期積分和進(jìn)展積分的患者顯示最差的生存。
　　結(jié)論:①改進(jìn)的流式積分系統(tǒng)無(wú)論是診斷低危MDS還是高危MDS均展現(xiàn)了良好的敏感性和特異性,有助于我們?cè)谂R床診斷前提供一個(gè)初步診斷或協(xié)助診斷;②兩種針對(duì)疾病早期或進(jìn)展的積分分布設(shè)定可協(xié)助我們對(duì)MDS患者分類(lèi)和預(yù)后進(jìn)行合理判斷;③獨(dú)特的抗原表達(dá)模式和流式積分分布反映了疾病克隆性演化的階段特點(diǎn)。
　　下

13、篇PcG家族蛋白在MDS表觀(guān)遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制中的作用研究
　　第三章 MDS患者PcG家族基因表達(dá)水平分析以及與p15INK4B甲基化、表觀(guān)遺傳治療和疾病預(yù)后的關(guān)系
　　目的:PcG家族是影響表觀(guān)遺傳學(xué)修飾的關(guān)鍵基因家族,然而其在MDS中的研究罕見(jiàn)報(bào)道。在本章節(jié)中,我們首次研究MDS患者骨髓PcG家族基因BM11、EZH2、RING1、SUZ12和EED表達(dá)水平,并分析其與p15INK4B甲基化、地西他濱治療和疾病預(yù)后的關(guān)系。

14、
　　材料與方法:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)21例正常對(duì)照、54例MDS患者、15例MDS轉(zhuǎn)化的AML(MDS-AML)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞PcG家族基因BMI1、RING1、EZH2、SUZ12和EED表達(dá)水平;地西他濱治療前后的PcG基因表達(dá)水平也被檢測(cè);甲基化特異性PCR檢測(cè)MDS患者p15INK4B甲基化狀況。在此基礎(chǔ)上,分析PcG家族基因表達(dá)與p15INK4B甲基化、地西他濱治療、IPSS預(yù)后積分及生存時(shí)間的關(guān)系。

15、　　結(jié)果:①與正常對(duì)照相比,MDS和MDS-AML患者BMI1、EZH2和RING1基因表達(dá)水平明顯增高,而SUZ12和EED表達(dá)水平無(wú)明顯差別;高危MDS與低危MDS相比有著更高的BMI1、EZH2和RING1基因表達(dá);在MDS患者中,BMI1、EZH2和RING1三者表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的同步相關(guān)性。②70.4％的MDS病人展現(xiàn)p15INK4B甲基化:與無(wú)p15INK4B甲基化的病人相比,p15INK4B甲基化的MDS病人伴有明顯增高的

16、EZH2基因表達(dá),但不伴有BMI1、RING1、SUZ12和EED表達(dá)增高。③地西他濱治療后p15INK4B甲基化異常頻率下降,EZH2和RING1表達(dá)水平明顯下降,但BMI1表達(dá)水平與治療前無(wú)明顯差別。④增高BMI1、EZH2和RING1基因表達(dá)水平與患者不利的IPSS預(yù)后積分正相關(guān),此外也與患者外周血細(xì)胞減少?lài)?yán)重程度和骨髓原始細(xì)胞比例增高正相關(guān)。⑤BMI1、EZH2和EED表達(dá)水平高的患者伴有較差的生存,而RING1和SUZ12表達(dá)

17、水平對(duì)生存無(wú)顯著影響;BMI1和EZH2是MDS患者獨(dú)立的預(yù)后因素。
　　結(jié)論:①PcG家族基因BMI1、EZH2和RING1的過(guò)表達(dá)頻繁發(fā)生于MDS,且預(yù)示著患者不利的預(yù)后積分和生存。②EZH2高表達(dá)伴隨著高的p15INK4B甲基化發(fā)生,且在地西他濱治療后表達(dá)明顯下降,提示了EZH2可能參與了MDS的表觀(guān)遺傳學(xué)發(fā)病。
　　第四章 PcG蛋白BMI1在MDS克隆細(xì)胞增殖凋亡轉(zhuǎn)換中的作用機(jī)制研究
　　目的:PcG蛋白BM

18、I1在正常造血和白血病干細(xì)胞的自我更新和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。上一章我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MDS患者單個(gè)核細(xì)胞過(guò)表達(dá)BMI1 mRNA且預(yù)示著不利的預(yù)后生存。在本章節(jié),我們將在CD34+細(xì)胞和MDS細(xì)胞系上研究PcG蛋白BMI1與MDS克隆細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系,探討其在克隆細(xì)胞凋亡增殖轉(zhuǎn)換中的作用。
　　材料與方法:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)34例MDS患者骨髓CD34+細(xì)胞BMI1 mRNA/蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡;構(gòu)建BMI1的真

19、核基因表達(dá)質(zhì)粒和siRNA干擾體系,采用Annexin V法、MTT法和7-AAD標(biāo)記研究BMI1過(guò)表達(dá)或低表達(dá)對(duì)MDS來(lái)源的細(xì)胞系MDS-L的凋亡、增殖和細(xì)胞周期的影響,采用免疫印跡檢測(cè)BMI1下游蛋白的表達(dá)來(lái)研究其效應(yīng)機(jī)制;最后,在不同的細(xì)胞毒藥物作用下,評(píng)估BM1過(guò)表達(dá)或低表達(dá)的MDS-L細(xì)胞對(duì)這些藥物的凋亡敏感性。
　　結(jié)果:①與正常對(duì)照相比,高危MDS患者CD34+細(xì)胞高表達(dá)BMI1 mRNA和蛋白,低危MDS患者并無(wú)B

20、MI1的明顯高表達(dá);MDSCD34+細(xì)胞凋亡與BMI1表達(dá)呈現(xiàn)明顯的反相關(guān)。②MDS患者存在明顯異常的增殖凋亡比,高危MDS患者BMI1/p53比值明顯增高;盡管低危MDS伴隨有p53的高表達(dá),BMI1/p53比值也顯著高于正常對(duì)照。③過(guò)表達(dá)BMI1的MDS-L細(xì)胞呈現(xiàn)更強(qiáng)的增殖活力,細(xì)胞的自身凋亡也明顯受抑;而B(niǎo)MI1沉默后的MDS-L細(xì)胞則呈現(xiàn)明顯受抑的增殖和增高的凋亡。細(xì)胞周期分析顯示過(guò)表達(dá)BMI1的MDS-L細(xì)胞呈現(xiàn)增加的S期細(xì)

21、胞,而B(niǎo)MI1的沉默導(dǎo)致明顯的G1期阻滯。④BMI1的過(guò)表達(dá)明顯抑制p16INK4A、phos-p53(ser46)表達(dá)和Caspase3/9等凋亡蛋白的剪切,而B(niǎo)MI1的沉默能夠增強(qiáng)p16INK4A、phos-p53(ser46)、bax表達(dá)和和Caspase3/9等凋亡蛋白的剪切。⑤BMI1的沉默增強(qiáng)TNF-alpha和TRAIL誘導(dǎo)的MDS-L細(xì)胞凋亡。BMI1過(guò)表達(dá)的MDS-L細(xì)胞耐受AZA和DAC的毒性:而B(niǎo)MI1被抑制后,A

22、ZA和DAC誘導(dǎo)的凋亡明顯增加。⑥與低表達(dá)BMI1的患者相比,高表達(dá)BMI1的患者IPSS預(yù)后積分增高,生存時(shí)間縮短。
　　結(jié)論:①M(fèi)DS克隆細(xì)胞通過(guò)BMI1的過(guò)表達(dá)抑制多種凋亡蛋白,抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖,誘導(dǎo)克隆細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗和藥物耐受,從而維持惡性生物學(xué)特征。②BMI1可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn),其表觀(guān)遺傳學(xué)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　第五章 PcG蛋白EZH2在MDS表觀(guān)遺傳學(xué)發(fā)病中作用的初步研究
　　目的

23、:PcG蛋白EZH2在組蛋白H3K27甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄沉默中發(fā)揮關(guān)鍵作用,然而其在MDS中的作用尚無(wú)研究。在本章節(jié),我們初步研究MDS患者PcG蛋白EZH2的基因功能定位及過(guò)表達(dá)的發(fā)生機(jī)制,為進(jìn)一步深入研究EZH2在MDS表觀(guān)遺傳學(xué)發(fā)病中作用奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)34例MDS患者骨髓CD34+細(xì)胞EZH2 mRNA/蛋白表達(dá)和和細(xì)胞凋亡:采用Agilent miRNAs微陣列分析獲取

24、MDS患者和正常對(duì)照CD34+細(xì)胞miRNAs譜的差異性表達(dá),分析靶向EZH2 miRNAs的表達(dá)狀況;采用基于Taqman miRNAs檢測(cè)的熒光定量PCR驗(yàn)證靶向EZH2的miRNAs表達(dá)狀況;采用定量PCR在MDS細(xì)胞系和多個(gè)AML細(xì)胞系中檢測(cè)EZH2表達(dá)和相應(yīng)的靶向miRNA表達(dá)。綜合分析EZH2表達(dá)和相應(yīng)miRNAs表達(dá)的關(guān)系。
　　結(jié)果:①與正常對(duì)照相比,低危MDS和高危MDS患者CD34+細(xì)胞均高表達(dá)EZH2 mRN

25、A和蛋白,在MDS和AML細(xì)胞系也得到類(lèi)似的結(jié)果;EZH2蛋白表達(dá)與BMI1蛋白表達(dá)明顯呈正相關(guān),但與MDS CD34+細(xì)胞凋亡呈反相關(guān);②來(lái)自于正常人和MDS患者CD34+細(xì)胞的microRNAs表達(dá)譜分析顯示靶向EZH2的microRNAs包括miR-26a,miR-98,miR-101和let-7a表達(dá)下調(diào)。③定量PCR驗(yàn)證分析顯示與正常對(duì)照相比,MDS患者中miR-101和miR-26a表達(dá)明顯下調(diào),而let-7a和miR-98

26、表達(dá)無(wú)明顯變化。④靶向EZH2的miRNA表達(dá)與EZH2 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析顯示miR-101和miR-26a的表達(dá)與EZH2 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯的反相關(guān),miR-101和miR-26a的下調(diào)是導(dǎo)致了EZH2的過(guò)表達(dá)的一個(gè)重要因素。⑤MDS和白血病細(xì)胞系靶向EZH2的miRNA分析顯示MDS-L細(xì)胞和KG1a細(xì)胞miR-101和miR-26a表達(dá)明顯下調(diào),而結(jié)果①顯示在MDS-L和KG1a細(xì)胞中EZH2的表達(dá)最高。
　　結(jié)論