喉癌中ZNF403基因表達(dá)異常及其機(jī)制研究.pdf

1、喉癌 (Laryngeal carcinoma)是一種常見(jiàn)的上呼吸道惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的1％-8.4％，病理分型93％-99％為鱗狀細(xì)胞癌。其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟的過(guò)程，涉及多個(gè)相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控的改變。如：Ras、 c-Myc、EGFR、Cyclin D1等瘤基因的擴(kuò)增；抑瘤基因p53，Rb的突變。Cyclin D1是參與調(diào)控G1/S期檢測(cè)點(diǎn)的重要蛋白之一，其功能是促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化。如果Cyclin D1過(guò)量表達(dá)

2、，將使細(xì)胞G1期縮短，導(dǎo)致細(xì)胞分化不足。Cyclin D1在多種實(shí)質(zhì)性腫瘤表達(dá)增高，是多種頭頸部鱗癌的分子標(biāo)志。研究表明，Cyclin D1在喉癌組織表達(dá)量要明顯高于正常粘膜，并且與病人生存率及病理分型具有明顯的相關(guān)性。ZNF403又名DIF-3，可以在轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平抑制Cyclin D1的表達(dá)。該基因定位于人染色體17q12，位于17q12～21.1上的雜合性丟失的高頻區(qū)域。編碼697個(gè)氨基酸的具有指狀結(jié)構(gòu)域的蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)

3、現(xiàn)ZNF403 mRNA在喉癌組織中表達(dá)下調(diào)，可能與喉癌的發(fā)生相關(guān)。本研究擬從以下兩個(gè)方面探討ZNF403基因在喉癌組織中表達(dá)異常的機(jī)制。 1．多種腫瘤細(xì)胞系及喉癌組織中ZNF403 mRNA的表達(dá)分析 為了分析ZNF403是否與喉癌相關(guān)，我們選取了染色體17q存在缺失，突變和擴(kuò)增的腫瘤細(xì)胞系和30例喉癌及配對(duì)的癌旁正常組織，采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)ZNF403 mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：喉癌細(xì)胞系Hep-2中ZN

4、F403 mRNA的表達(dá)較其他腫瘤細(xì)胞低，而在30例喉癌及配對(duì)癌旁正常組織中有18例在喉癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，另有2例在喉癌及配對(duì)癌旁組織中均檢測(cè)不到ZNF403 mRNA的表達(dá)。ZNF403 mRNA在喉癌組織的表達(dá)下調(diào)與患者的年齡，TNM分期無(wú)關(guān)(p>0.05)。 2 喉癌細(xì)胞系Hep-2及喉癌組織中ZNF403基因表達(dá)下調(diào)原因分析 為了分析ZNF403基因在喉癌組織中ZNF403基因表達(dá)下調(diào)機(jī)制，我們首先選取了位于

5、染色體17q12的三個(gè)STS(WI22201，WI16428，RH78009)，其中WI16428位于ZNF403基因3′-UTR。WI22201，RH78009分別位于WI16428上下游。采用PCR-變性聚丙烯酰氨凝膠電泳的方法檢測(cè)了30例喉癌及配對(duì)的癌旁正常組織中這3個(gè)位點(diǎn)的雜合性丟失(LOH)情況(若等位基因?yàn)榧兒献樱瑒t記為無(wú)信息)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30例喉癌組織中有3例在W116428位點(diǎn)出現(xiàn)LOH (3/28)，2例在RH

6、78009位點(diǎn)出現(xiàn)LOH(2/29)，無(wú)一例在WI22201位點(diǎn)出現(xiàn)LOH，但1例發(fā)生純合性丟失。在發(fā)生LOH的喉癌組織中均出現(xiàn)ZNF403 mRNA的下調(diào)，但由于喉癌中LOH的頻率較低，不能完全說(shuō)明喉癌組織中ZNF403 mRNA下調(diào)的原因，提示LOH可能不是引起喉癌中ZNF403基因異常表達(dá)的主要因素。 隨后，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，ZNF403基因啟動(dòng)子區(qū)域位于開(kāi)放閱讀框起點(diǎn)上游-1370至-607bp

7、。該序列長(zhǎng)764bp，富含CG。我們檢測(cè)了30例喉癌及配對(duì)癌旁組織ZNF403基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況，結(jié)果顯示：喉癌組織中ZNF403基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化率為83％(25／30)，在配對(duì)癌旁組織中的甲基化率為46.7％(14/30)，喉癌組織中ZNF403基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯高于癌旁組織(P<0.001)，提示喉癌組織中ZNF403基因表達(dá)下調(diào)可能與其啟動(dòng)子的DNA甲基化相關(guān)。 為了進(jìn)一步分析ZNF403基因

8、啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與ZNF403基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性，我們用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮-2-脫氧胞苷處理的Hep-2細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR和甲基化特異性PCR分別檢測(cè)處理前后Hep-2細(xì)胞中ZNF403 mRNA的表達(dá)情況及其基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示：Hep-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度的5-雜氮-2-脫氧胞苷處理24h后，ZNF403表達(dá)量逐漸上升。在1uM濃度處ZNF403表達(dá)量最高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Hep-2細(xì)胞經(jīng)5-Aza處理24h后，