線粒體及其調(diào)控基因在糖脂異常發(fā)生機(jī)制中的作用.pdf

1、目的：
　　線粒體基因突變與線粒體DNA拷貝量減少共同參與線粒體功能障礙的發(fā)生，線粒體DNA拷貝量減少在年齡相關(guān)退行性疾病-2型糖尿病發(fā)病中起到重要的驅(qū)動性作用。本研究將從線粒體單基因突變的線粒體糖尿病家系入手，結(jié)合2型糖尿病的發(fā)病進(jìn)程，探討線粒體功能障礙與糖脂代謝異常的關(guān)系。通過建立線粒體內(nèi)膜調(diào)控氧化磷酸化解偶聯(lián)作用的解偶聯(lián)蛋白2(Uncoupling Protein2，UCP2)基因敲除小鼠高脂飼養(yǎng)模型，探索UCP2及其上游調(diào)

2、控基因在糖脂代謝中的作用，并在血糖譜連續(xù)的人群中（健康人群-糖尿病前期-2型糖尿病）分析UCP2及其上游調(diào)控基因氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome ProliferatorActivated Receptorγ，PPARγ)基因多態(tài)性特點。探尋飲食結(jié)構(gòu)對線粒體功能及對位于染色體末端生物學(xué)老化的標(biāo)志物-端粒長度(Telomere Length，TL)的影響，分析飲食在線粒體介導(dǎo)糖脂代謝異常中的作用，從遺傳、環(huán)境因素兩方面探討

3、2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制。同時，探討血脂比(TG/HDL-C)能否作為評估胰島素抵抗以及胰島β細(xì)胞分泌功能受損的臨床指標(biāo)，尋找預(yù)測2型糖尿病胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能的簡易標(biāo)志物。
　　方法：
　　人群研究對象:①線粒體糖尿病患者來自2007年4月至2015年12月間在北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的線粒體DNA3243 A＞G位點突變的線粒體糖尿病患者16例;②血糖譜連續(xù)人群來自2014年3月至2015年1月間北京農(nóng)村社區(qū)2型糖尿病

4、管理模式的建立項目共599人;③隊列研究基線人群來自2005年4月-2006年4月就診于北京協(xié)和醫(yī)院門診的76例2型糖尿病患者。收集一般人口學(xué)特征、臨床、生化資料、飲食結(jié)構(gòu)問卷。線粒體DNA3243位點基因突變檢測采用直接測序法（Sanger法），突變位點堿基G/A峰值比定義為=堿基G峰值高度÷堿基A峰值高度。外周血線粒體DNA拷貝量、端粒長度的測定采用熒光實時定量多聚酶式反應(yīng)?；蚨鄳B(tài)性分析采用質(zhì)譜檢測平臺，檢測8個UCP2功能區(qū)多態(tài)

5、性位點(rs660339、rs659366、rs649446、rs586773、rs34408426、rs7109266、rs3019463、rs591758)，7個PPARγ功能區(qū)多態(tài)性位點(rs3856806、rs2920502、 rs17029007、rs73021485、rs73813168、rs2920503、rs79310821)。氧化應(yīng)激指標(biāo)（SOD、GR、8-oxo-dG）、炎癥因子（IL-6、TNF-α）測定采用酶聯(lián)免

6、疫吸附法測定。
　　動物研究:C57BL/6背景的雄性UCP2-/-小鼠和同周齡C57BL/6背景的UCP2+/+小鼠。高脂飼養(yǎng)16周。肝臟組織基因表達(dá)譜采用全基因組表達(dá)芯片分析(Affymetrix Mouse Gene ST1.0 array)。
　　結(jié)果：
　　1.線粒體DNA3243 A＞G突變糖尿病患者臨床特點及突變異質(zhì)性與疾病譜間的關(guān)系
　　16例線粒體糖尿病患者（起病年齡:35.0±14.6歲）伴明

7、確的母系遺傳家族史、體型偏瘦(BMI:19.5±2.36 kg/m2)、耳聾累及高頻域。線粒體DNA3243位點A＞G突變G/A峰值比與發(fā)病年齡呈顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=-0.841，P＜0.001)。
　　2.外周血線粒體DNA拷貝量與葡萄糖刺激后胰島β細(xì)胞分泌功能的關(guān)聯(lián)分析
　　外周血線粒體DNA拷貝量與口服葡萄糖耐量后早相、總體胰島素分泌指數(shù)呈顯著性正相關(guān)，與30min、60min、120min血糖呈顯著性負(fù)相關(guān)，與空

8、腹胰島素分泌指數(shù)、血糖、血脂并不存在顯著性相關(guān)。多元線性回歸分析表明，外周血線粒體DNA拷貝量減少可增加葡萄糖刺激后β細(xì)胞功能受損風(fēng)險(DI30∶β=0.104，P=0.019; DI120∶β=0.116，P=0.009)。多元logistic回歸分析表明外周血線粒體DNA拷貝量與2型糖尿病發(fā)生風(fēng)險呈顯著性負(fù)相關(guān)(OR:0.468，95％CI:0.245-0.893，P=0.021)。
　　3.UCP2在糖脂代謝中的作用及其代謝

9、通路分析
　　持續(xù)高脂飼養(yǎng)狀態(tài)下，UCP2-/-小鼠胰島β細(xì)胞功能和胰島素敏感性好于UCP2+/+小鼠，UCP2-/-小鼠血清總膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸顯著性低于UCP2+/+小鼠。根據(jù)肝臟基因芯片分析，UCP2-/-組與UCP2+/+組間，“PPAR信號通路”中7種基因表達(dá)顯著性上調(diào)，包括PPARγ，Acsl3，Lpl，Me1，Scd1，F(xiàn)ads2。PPAR另外兩種異構(gòu)體—PPARα、PPAR6基因表達(dá)量在UCP2-/-組和

10、UCP2+/+組間并不存在顯著性差異。
　　4.人群UCP2-PPARγ多態(tài)性與糖脂代謝異常相關(guān)性研究
　　8個UCP2基因SNP位點等位基因、基因型在不同糖代謝狀態(tài)人群間不存在顯著性差異。PPARγ基因rs2920502位點等位基因堿基G、基因型GG時是糖代謝異常的保護(hù)因素(等位基因OR:0.818，95％ CI:0.526-0.969，P=0.042;基因型OR:0.715，95％ CI:0.527-0.97，P=0.0

11、31)，GG基因型血脂TC、TG、LDL-C、TG/HDL-C低于GC、CC基因。rs3856806位點等位基因堿基T、等位基因TT時是糖代謝異常的危險因素（等位基因0R:1.46，95％CI:1.055-2.017，P=0.022;基因型OR:1.58，95％CI:1.104-2.761，P=0.032）。
　　5.線粒體糖尿病與2型糖尿病、正常人群外周血DNA端粒長度比較
　　端粒長度在線粒體糖尿病、2型糖尿病組顯著性低

12、于正常對照組，但線粒體糖尿病和2型糖尿病組間并不存在顯著性差異(線粒體糖尿病vs2型糖尿病vs正常對照:1.28±0.54 vs1.14±0.43 vs1.63±0.61，P=0.000)。外周血DNA端粒長度與線粒體DNA3243突變位點堿基G/A峰值比并不存在顯著性相關(guān)性(r=-0.156，P=0.646)。
　　6.飲食成分、碳水化合物構(gòu)成比對外周血DNA端粒長度及血糖的影響
　　糖尿病組端粒長度較正常對照組顯著性縮短

13、(log(TL):血糖正常組vs糖尿病前期組vs糖尿病組:2.01±0.03 vs1.97±0.03 vs1.89±0.03，P=0.005)。端粒長度與每日飲食總能量攝入及飲食中脂類/碳水化合物比例不存在顯著性相關(guān)，多元線性回歸分析表明，豆制品、堅果、魚類、海藻類是端粒長度的保護(hù)因素，甜飲料是其危險因素(豆類:β=0.105，P=0.018;堅果:β=0.110，P=0.011;魚類:β=0.118，P=0.007;海藻類:β=0.1

14、16，P=0.009)。飲食中脂類、碳水化合物構(gòu)成比和谷類、肉類與TNF-α呈顯著性正相關(guān)（脂類:r=0.119，P=0.008;碳水化合物:r=0.094，P=0.043;谷類:r=0.091，P=0.048;肉類:r=0.405，P=0.009)。海藻類、奶制品攝入量與8-oxo-dG呈顯著性負(fù)相關(guān)（海藻類:r=-0.496，P=0.001;奶制品:r=-0.246，P=0.046），蔬菜、水果類攝入與GR呈顯著性正相關(guān)(蔬菜:r=

15、0.101，P=0.034;水果:r=0.125，P=0.045)。
　　7.血脂比TG/HDL-C對胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能的預(yù)測作用
　　血糖譜連續(xù)的人群中，TG/HDL-C、TG可作為預(yù)測胰島素抵抗的血脂標(biāo)志(TG/HDL-C: ROC曲線下面積(AUROC):0.71，95％CI:0.66-0.75，P=0.000; TG: AUROC:0.71，95％ CI:0.65-0.75，P=0.000);診斷胰島素抵抗T

16、G/HDL-C、TG最佳切點值分別為:1.11，1.33mmol/L。TG/HDL-C與HOMA-β存在顯著性負(fù)相關(guān)，ROC曲線下面積均小，不宜作為判斷β細(xì)胞分泌受損的指標(biāo)。
　　結(jié)論：
　　1.早發(fā)糖尿病患者伴母系遺傳家族史、BMI正?；蚱荨⒍@可強(qiáng)烈提示線粒體糖尿病的存在。外周血DNA直接測序法對線粒體DNA3243位點A＞G突變進(jìn)行鑒定，其突變G/A峰值比對線粒體疾病的起病年齡及疾病嚴(yán)重程度可起到簡單的預(yù)測作用。

17、r>　　2.在血糖譜連續(xù)的人群中，本研究首次發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA拷貝量與葡萄糖刺激后的早相、總體胰島素分泌功能呈顯著性正相關(guān)，其對于餐后血糖的影響大于對空腹血糖的影響。
　　3.UCP2缺乏通過PPAR信號通路提高胰島素敏感性和β細(xì)胞功能來改善血糖、血脂，PPARγ多態(tài)位點(rs2920502、rs3856806)與糖脂代謝密切相關(guān)，是高脂飲食狀態(tài)下調(diào)控UCP2表達(dá)的重要基因。
　　4.端粒長度縮短可能參與糖尿病的發(fā)病機(jī)制，但