TRIM24在喉癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　喉癌(laryngeal carcinoma)為原發(fā)于喉部的惡性腫瘤，其病理類型以鱗狀細(xì)胞癌為主，男性多發(fā)，喉癌的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，一般認(rèn)為與吸煙、飲酒、病毒感染、環(huán)境及放射線等因素有關(guān)。我國(guó)是喉癌高發(fā)地區(qū)，北方發(fā)病率較南方高，東部地區(qū)高于西部。目前喉癌的治療以手術(shù)為主，放療及化療為輔。接受系統(tǒng)治療的早期喉癌患者預(yù)后尚可，但晚期預(yù)后不佳。喉有著重要的生理功能，包括發(fā)音、呼吸、吞咽等，因喉癌行喉部手術(shù)治療后，喉

2、功能將因手術(shù)導(dǎo)致不同程度的損傷，嚴(yán)重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量，也給社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因與喉癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但其發(fā)病的病理分子機(jī)制仍不清楚，探討其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)喉癌的診斷、治療以及預(yù)防等方面都具有重要意義，隨著近年分子生物學(xué)研究的快速進(jìn)展，通過基因靶點(diǎn)等方法治療喉癌將為患者帶來新的希望。
　　TRIM24(tripartite motif24)是TRIM家族重要成員之一，也是泛素蛋白連接酶E3家族成員，其

3、編碼基因位于7號(hào)染色體q32-q34，氨基端依次連接三種重要的結(jié)構(gòu)域，分別為1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域、2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)coil-coiled結(jié)構(gòu)域，羧基端連接保守的PHD和Bromo結(jié)構(gòu)域。TRIM24因其具有典型的RING結(jié)構(gòu)域，使其具備E3連接酶的功能，如它可以結(jié)合并介導(dǎo)p53的泛素化降解。TRIM24又名轉(zhuǎn)錄中介因子1α（transcriptional intermediary factor1α，TIF1α），在細(xì)胞核內(nèi)，它可

4、以通過配體的形式與多種核受體相互作用，包括雌激素、維甲酸和維生素D3受體等。目前，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道TRIM24在肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、膀胱癌等多種腫瘤組織中存在高表達(dá)，并且與腫瘤惡性進(jìn)展和不良預(yù)后呈正相關(guān)，但在喉癌中尚未見報(bào)道。
　　本研究旨在檢測(cè)TRIM24蛋白在喉癌中的表達(dá)情況和其與臨床病理因素的相關(guān)性，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討TRIM24在喉癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，研究其對(duì)喉癌細(xì)胞增殖及侵襲能力影響及機(jī)制。
　　方

5、法：
　　喉癌組織標(biāo)本來自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，喉癌及癌旁標(biāo)本來自2010年9月至2015年8月就診于我院耳鼻咽喉科行喉癌手術(shù)治療的患者。所有患者術(shù)前均未接受過任何放射治療及化學(xué)治療。標(biāo)本分別進(jìn)行福爾馬林固定石蠟包埋和-80℃低溫保存。石蠟包埋的喉癌組織及癌旁組織切片后進(jìn)行常規(guī)的HE染色，分別由2名醫(yī)生依據(jù)2005年WHO病理診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷，之后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。-80℃冰凍保存的標(biāo)本進(jìn)行real-time PCR及wester

6、n blot檢測(cè)，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析臨床病理資料與TRIM24表達(dá)間的關(guān)系。Hep2細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遺傳教研室惠贈(zèng)，使用含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％的CO2、飽和濕度，使用質(zhì)粒(OriGene)轉(zhuǎn)染上調(diào)TRIM24在Hep2細(xì)胞中的表達(dá)，通過siRNA(ThermoFisher，Lafayette，CO，USA)下調(diào)TRIM24的表達(dá)。通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)及transwell侵襲

7、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TRIM24表達(dá)情況對(duì)Hep2細(xì)胞的增殖和侵襲能力的影響。采用western blot方法檢測(cè)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)p-AKT、cyclin D1、Bcl-2、MMP-2等表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化結(jié)果表明TRIM24在晚期喉癌組織中表達(dá)量明顯升高(12/16);western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)28例新鮮中晚期喉癌標(biāo)本中，TRIM24蛋白在喉癌組織中高表達(dá)(25/28)，real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明28

8、例新鮮中晚期喉癌標(biāo)本中，TRIM24mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(23/28);
　　2、轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞可以獲得TRIM24蛋白表達(dá)的改變，pCMV6-TRIM24質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使Hep2細(xì)胞中TRIM24高表達(dá);siRNA干擾使Hep2細(xì)胞中TRIM24的表達(dá)量下降;
　　3、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明TRIM24高表達(dá)時(shí)Hep2細(xì)胞的增殖及侵襲能力增強(qiáng);
　　4、高表達(dá)TRIM2

9、4使Hep2細(xì)胞中p-AKT、cyclin D1、Bcl-2及MMP-2的表達(dá)水平升高。
　　結(jié)論：
　　1、在喉癌組織中，TRIM24 mRNA、蛋白表達(dá)水平均升高，其表達(dá)水平與臨床分期正相關(guān)。
　　2、在中晚期喉癌中TRIM24表達(dá)水平升高明顯，其在喉癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用;
　　3、TRIM24高表達(dá)的pCMV6-TRIM24-Hep2細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力和侵襲能力;
　　4、TRIM24對(duì)He