低強(qiáng)度脈沖超聲波對(duì)牙周膜細(xì)胞成骨分化影響的初步研究.pdf

1、hPDLCs是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性多能干細(xì)胞,包含成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞及未分化間充質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞成分；它可分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞并形成牙槽骨、牙骨質(zhì)及牙周膜,是牙周組織再生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),尤其對(duì)于牙周病治療具有極其重要的研究?jī)r(jià)值。牙周病治療終極目的是牙周組織再生和形成新附著。促進(jìn)牙周組織再生的關(guān)鍵之一是牙槽骨新生,即誘導(dǎo)hPDLCs成骨分化并行使功能。在牙周病損區(qū)域中,hPDLCs數(shù)量和功能活性都是有限的。如

2、何促進(jìn)該區(qū)域牙周膜細(xì)胞增殖及骨向分化對(duì)牙周病組織修復(fù)具有不可估量的研究?jī)r(jià)值。近年來(lái),LIPUS因其具有縮短骨折愈合時(shí)間、增加骨密度、改善力學(xué)特性,促使軟骨骨化成熟等生物作用而被作為一種無(wú)創(chuàng)、安全、有效的治療方法廣泛用于骨折延遲愈合和骨不連等疾病治療。大量研究證實(shí)LIPUS作為一種機(jī)械信號(hào),具備以下組織作用機(jī)制：促進(jìn)組織中具有增殖分化潛能的前體細(xì)胞增殖及成骨分化；增強(qiáng)功能細(xì)胞生物活性；改善血液循環(huán)。因此,本研究首次將LIPUs引入誘導(dǎo)hP

3、DLCs成骨分化以促進(jìn)牙周組織再生治療的研究具有重要意義。
　　 目的：⑴建立hPDLCs的LIPUS體外輻照模型,為下一步研究LIPUS對(duì)hPDLCs成骨分化影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。⑵通過(guò)連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察LIPUS對(duì)hPDLCs合成分泌堿性磷酸酶、骨鈣素的影響,探討LIPUS是否具有hPDLCs骨向誘導(dǎo)分化能力并遴選適宜參數(shù)。⑶以多個(gè)具有重要生理功能并可能在力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中處于調(diào)控樞紐地位的分子為切入點(diǎn),研究LIPUS對(duì)hPDLCs in

4、tegrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1mRNA表達(dá)的影響,為揭示LIPUS對(duì)hPDLCs成骨分化調(diào)控機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：①采用組織塊法原代培養(yǎng)hPDLCs并傳代建立有限細(xì)胞系,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞組織學(xué)來(lái)源鑒定、繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,為下一步LIPUS輻照提供實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。②采用第4代hPDLCs消化后接種于6孔板中,LIPUs輻照參數(shù)為:工作頻率1.5MHz；脈沖重復(fù)頻率1.0KHz；脈沖占空比1:4,幅

5、寬:200us；按輸出強(qiáng)度90mW/cm2、60mW/cm2、30mW/cm2；同一聲強(qiáng)輻照時(shí)間為10min,20min,30min分組,連續(xù)作用5天后檢測(cè)各組ALP活性并遴選適宜的輻照參數(shù)用于后續(xù)試驗(yàn)。③采用第5代hPDLCs,按90mW/cm2-20min/d連續(xù)輻照15天,分別于5、7、9、11、13、15天時(shí)間點(diǎn),采用生化法和放射免疫法檢測(cè)堿性磷酸酶和骨鈣素合成分泌情況。④取第5代hPDLCs,以90mW/cm2-20min/d

6、 LIPUS輻照處理5d,鏡下見(jiàn)細(xì)胞匯合約90％,收集需要檢測(cè)的細(xì)胞,采用RT-PCR檢測(cè)integrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1的mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：⑴本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的hPDLCs細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線均與文獻(xiàn)報(bào)道相近,免疫組化證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源于中胚層,結(jié)合取材部位說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞為牙周膜細(xì)胞,可用于本實(shí)驗(yàn)研究。⑵經(jīng)LIPUS輻照后,各組ALP活性均有不同程度提高,其中90mW/cm2-20min/d組

7、改變最為明顯。⑶LIPUS連續(xù)輻照15天研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞裂解液中的ALP于第5天開(kāi)始增加,第11天達(dá)峰值,第13天下降較明顯；分泌至上清液中的ALP于第9天開(kāi)始增加,第11天達(dá)峰值,第13天時(shí)開(kāi)始下降。同時(shí),上清液中骨鈣素于第9天顯著增加,第15天達(dá)峰值。⑷以90mW/cm2-20min/d LIPUS輻照處理5d,引起integrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1mRNA表達(dá)不同程度上調(diào)。
　　 結(jié)論：①LIPUS對(duì)h

8、PDLCs骨向分化具有促進(jìn)作用,本實(shí)驗(yàn)條件下較適宜作用參數(shù)為90mW/cm2-20m in/d。②LIPUS(90mW/cm2-20min/d)連續(xù)作用15d,牙周膜細(xì)胞ALP合成于第5天開(kāi)始增加,第9天開(kāi)始ALP向胞外分泌增加,第11天時(shí)合成及分泌同時(shí)達(dá)峰值,于第13天時(shí)均有下降。骨鈣素作為成骨分化晚期標(biāo)志蛋白,分泌于第9天顯著增加,第15天達(dá)峰值,LIPUS誘導(dǎo)合成高峰稍晚于堿性磷酸酶。③LIPUS輻照下integrinβ1、c-f

9、os、c-jun、cbfa1表達(dá)均有上調(diào),提示上述基因可能參與了LIPUS誘導(dǎo)hPDLCs骨向分化的調(diào)控過(guò)程。推測(cè)其可能機(jī)制為:LIPUS以機(jī)械應(yīng)力信號(hào)為主要形式作用于hPDLCs上,首先影響“細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架”力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),通過(guò)MAPK信號(hào)通路將物理信號(hào)傳入核內(nèi),誘導(dǎo)即早基因c-fos、c-jun和成骨控制基因cbfa1轉(zhuǎn)錄翻譯增加,可能進(jìn)一步形成AP-1或與cbfa1相互調(diào)節(jié)影響成骨相關(guān)基因的表達(dá),如堿性磷酸酶、骨鈣