低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的影響.pdf

1、目的：
　　近年來(lái)，因建筑交通行業(yè)的迅猛發(fā)展和人口老齡化的加劇所導(dǎo)致的骨折嚴(yán)重危害著我們的健康，促進(jìn)骨折的愈合、注意避免發(fā)生骨折延遲愈合或不愈合仍是我們醫(yī)學(xué)界面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。低強(qiáng)度脈沖超聲（Low intensity pulsed ultrasound, LIPUS）以費(fèi)用低廉、無(wú)感染、無(wú)創(chuàng)傷、治療簡(jiǎn)單、無(wú)不良反應(yīng)、效果理想受到人們的關(guān)注，然而，LIPUS促進(jìn)骨愈合的作用機(jī)制目前仍不明確。我們分析LIPUS促進(jìn)骨愈合的關(guān)鍵是 LI

2、PUS通過(guò)加速 BMSCs多向分化來(lái)實(shí)現(xiàn)修復(fù)受損骨組織。因此，本課題我們將研究LIPUS對(duì)BMSCs多向分化的影響，計(jì)算LIPUS可以提高BMSCs分化的分化率。并將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，初步觀察LIPUS聯(lián)合BMSCs治療骨缺損的可行性。
　　方法：
　　1. BMSCS細(xì)胞分八個(gè)實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照組、成骨誘導(dǎo)組、血管內(nèi)皮誘導(dǎo)組、雙誘導(dǎo)組、超聲組、成骨誘導(dǎo)+超聲組、血管內(nèi)皮誘導(dǎo)+超聲組、雙誘導(dǎo)+超聲組。超聲組、成骨誘導(dǎo)+超聲組、血管內(nèi)皮

3、誘導(dǎo)+超聲組、雙誘導(dǎo)+超聲組細(xì)胞使用低強(qiáng)度脈沖超聲儀(LIPUS頻率0.6MHz,重復(fù)頻率1kHz,占空比20％)以0.03W/cm2的強(qiáng)度每天輻照20min，連續(xù)輻照13d；其余四組使用同樣方法進(jìn)行超聲假照。所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均于0d、1d、3d、7d、9d、11d、13d進(jìn)行MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，于5d、9d、13d取樣本進(jìn)行以下檢測(cè)：倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、、透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化、激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞成骨和血管內(nèi)皮分化情況、流

4、式細(xì)胞表面抗原檢測(cè)細(xì)胞分化率，熒光PCR檢測(cè)骨鈣素和vWF基因的表達(dá)。
　　2.將24只雌性SD大鼠隨機(jī)分為四組：對(duì)照組，LIPUS組，BMSCS組和BMSCS+LIPUS組。用直徑1.6mm的骨穿針建立統(tǒng)一的大鼠骨缺損“孔”狀模型。造模當(dāng)天各組開(kāi)始分別進(jìn)行治療，連續(xù)觀察4周，并于治療2周、4周后對(duì)各組大鼠進(jìn)行X線成像、股骨樣本采圖和HE染色等檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞形態(tài)觀察、電鏡檢測(cè)和共聚焦檢測(cè)顯示 LIPU

5、S輻照后的各組細(xì)胞，開(kāi)始分化的時(shí)間要早于對(duì)應(yīng)假照組，細(xì)胞向特定誘導(dǎo)方向分化的數(shù)量也多于對(duì)應(yīng)假照組。流式表面抗原檢測(cè)顯示超聲組細(xì)胞分化率達(dá)到（11±0.11），對(duì)照組分化率為（5.95±0.05），兩組間差異具有顯著性（P＜0.05）；成骨+超聲組細(xì)胞分化率達(dá)到（17.58±0.046），成骨組分化率為（10.39±0.08），兩組間差異具有顯著性（P＜0.05）；血管內(nèi)皮+超聲組細(xì)胞分化率達(dá)到（99.46±0.05），血管內(nèi)皮組分化率為

6、（96.97±0.03），兩組間差異具有顯著性（P＜0.05）；雙誘導(dǎo)+超聲組細(xì)胞分化率達(dá)到（34.79±1.21），雙誘導(dǎo)組分化率為（24.77±0.3），兩組間差異具有顯著性（P＜0.05）。熒光PCR結(jié)果顯示，不論骨鈣素基因還是vWF基因，所有超聲組的表達(dá)均明顯高于其對(duì)應(yīng)的假照組，除了第5天成骨與成骨+超聲組vWF基因表達(dá)、血管內(nèi)皮組與血管內(nèi)皮+超聲組OC基因表達(dá)沒(méi)有差異性（P>0.05）外，其余各組均是LIPUS作用后細(xì)胞OC基

7、因和vWF基因的表達(dá)高于其對(duì)應(yīng)的未進(jìn)行LIPUS輻照的實(shí)驗(yàn)組的基因，且差異具有顯著性（P＜0.05）。
　　2. LIPUS與BMSCs聯(lián)合治療大鼠骨缺損，結(jié)果顯示，LIPUS組與BMSCS組治療骨愈合均效果，兩組之間愈合情況差異不大，測(cè)試兩組未愈合骨組織表面積顯示兩組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但HE染色檢測(cè)中可以發(fā)現(xiàn)兩組的新生骨骨質(zhì)不如周邊正常骨。聯(lián)合治療組骨愈合情況明顯優(yōu)于LIPUS組和BMSCS組，4周時(shí)缺損處骨組織基

8、本修復(fù)，統(tǒng)計(jì)未愈合組織面積后與LIPUS組和BMSCS相比具有極顯著性差異（P＜0.01）。且根據(jù)HE染色結(jié)果來(lái)看，該組新生薄片骨骨組織排列整齊統(tǒng)一，還有新生血管生成。
　　結(jié)論：
　　1. LIPUS可以加速BMSCs向成骨和血管內(nèi)皮方向分化，使其更快生成骨組織和血管組織。在雙向同時(shí)誘導(dǎo)BMSCs時(shí)，可以看到BMSCs同時(shí)分化出血管和骨組織，這為以后生成血管化骨組織提供研究基礎(chǔ)。在雙向同時(shí)誘導(dǎo)條件下，LIPUS對(duì)BMSCs