白念珠菌高鐵還原酶FRP1基因與Rim101蛋白相互作用的研究.pdf

1、白念珠菌是念珠菌病原體中最常見的一種條件性致病菌,白念珠菌應(yīng)答的-個主要環(huán)境因素為細(xì)胞外的pH,這種應(yīng)答反應(yīng)是由保守的真菌信號傳導(dǎo)途徑RIM101途徑所控制,許多依賴pH表達(dá)的基因受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白所調(diào)控。從宿主中獲得鐵的能力對于白念珠菌的定居和存活是必需的。白念珠菌鐵獲得系統(tǒng)的調(diào)控對其生存和毒力非常重要,而細(xì)胞外的不同pH條件影響著鐵離子的生物可利用率,因此推測鐵獲得系統(tǒng)受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白調(diào)控。 通過對白念珠菌

2、高鐵還原酶基因FRP1啟動子進行突變分析,確認(rèn)啟動子中特殊調(diào)控元件。DNA微陣列結(jié)果顯示FRP1表達(dá)受Rim101蛋白調(diào)控。我們通過分析FRP1起始密碼子上游1K序列發(fā)現(xiàn)在-160和-650處有兩個推測的Rim101p結(jié)合位點,對其分別進行定點突變,然后構(gòu)建啟動子與報告基因1acZ融合質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化整合到白念珠菌,rim101-/-株和野生株中,檢測不同缺鐵條件下β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性條件,Rim101p能夠正向調(diào)控FRP1的表達(dá)

3、：啟動子-160處突變對啟動子功能影響較弱,而-650突變使啟動子活性大大降低,此結(jié)果和雙突變的結(jié)果相同,表明Rim101p主要通過與啟動子-650處結(jié)合位點相互作用來調(diào)控FRP1的表達(dá)。 為了驗證Rim101p是否直接結(jié)合GCCAAG位點,利用白念珠菌細(xì)胞總蛋白提取物進行EMSAs實驗發(fā)現(xiàn)Rim101p能直接與-160和-650探針結(jié)合,不同的培養(yǎng)條件(pH)不影響結(jié)合。將全長Rim101p和截短Rim101p分別在大腸桿菌中

4、成功表達(dá),重組蛋白EMSAs實驗進一步驗證Rim101p能直接結(jié)合GCCAAG位點。并且發(fā)現(xiàn)截短Rim101p只能與-650探針結(jié)合,說明截短(活性形式)Rim101p主要通過與啟動子-650位點結(jié)合調(diào)控FRP1表達(dá),這與啟動子突變結(jié)果一致。 為了尋找FRP1上游-822～-437和-263～124片斷中的特殊調(diào)控元件,本實驗分別將片段與IMH3中性啟動子連接,通過β-半乳糖苷酶活性的分析說明：-822～-437區(qū)域有促進啟動子