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文檔簡介
1、白念珠菌易于感染、難以防治的特點使其在臨床治療中表現(xiàn)為高致病性和高耐藥性。目前國際上對白念珠菌基因組的測序工作已經(jīng)完成,并可以通過公共數(shù)據(jù)庫可以獲得相應(yīng)的完整基因組序列。經(jīng)過DNA序列及編碼的氨基酸序列比對,發(fā)現(xiàn)一個白念珠菌新基因IPF19998與釀酒酵母中的AIF1基因有高度同源性。AIF1是與人類AIF同源的酵母細胞凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis inducing factor)。已經(jīng)證實在釀酒酵母中,在由H2O2或醋酸鹽誘發(fā)的凋
2、亡以及衰老過程中,Aiflp,從線粒體中轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi),并誘導(dǎo)細胞凋亡。在AIF1基因敲除菌株中,凋亡特征消失,衰老延緩[1]。由此我們推測,IPF19988是白念珠菌中的凋亡誘導(dǎo)因子,并在白念珠菌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用,對該基因的進一步研究有助于闡明白念珠菌細胞凋亡機制,為抗真菌感染藥物的研究設(shè)計提供新思路。
本課題采用Ura-Blaster基因敲除策略靶向敲除和pCaEXP質(zhì)粒異位表達凋亡誘導(dǎo)因子基因IPF1999
3、8,構(gòu)建了IPF19998基因缺失菌和高表達菌。將構(gòu)建好的菌株通過比濁法測定生長曲線;通過微量液基實驗來考察IPF19998缺失菌對唑類藥物的敏感性及過氧化氫的刺激耐受性是否改變;將缺失菌在塑料培養(yǎng)板中按照生物被膜形成條件培養(yǎng)24小時并形成生物被膜,考察其生長動力學(xué)變化;通過熒光染料檢測IPF19998基因缺失菌在酵母態(tài)及被膜態(tài)兩種狀態(tài)下的內(nèi)源性活性氧水平(ROS),通過實時定量PCR考察了IPF19998基因缺失后,其他已知氧化還原相
4、關(guān)基因和生物被膜形成相關(guān)基因表達量的變化。結(jié)論:成功構(gòu)建白念珠菌IPF19998基因缺失菌和基因高表達菌株;IPF19998基因缺失后,菌株生長速度不變;但對唑類藥物敏感性沒有明顯變化,高表達菌株對唑類藥物產(chǎn)生耐藥性;對過氧化氫刺激所引起的凋亡也與野生菌相比,無明顯差異。這與我們前期設(shè)想的結(jié)論不同。但用熒光染料測其內(nèi)源性活性氧水平(ROS),與酵母態(tài)下生成的ROS含量相比,被膜態(tài)下的菌株,不論是敲除菌株,高表達菌株還是野生型菌株,其RO
5、S產(chǎn)生遠遠低于酵母態(tài)下的ROS產(chǎn)生。而在被膜態(tài)下,IPF19998基因缺失菌ROS產(chǎn)生增多,而高表達菌ROS產(chǎn)生保持一個穩(wěn)定且低的水平。同時,我們發(fā)現(xiàn),IPF19998基因缺失以后,其形成生物被膜的能力下降,高表達菌株生成生物被膜的能力明顯增強。這一結(jié)果在Real-time實驗中也得到證實。IPF19998基因能改變已知氧化還原相關(guān)基因和生物被膜形成相關(guān)基因表達量的變化。根據(jù)本研究推測,IPF19998基因可通過增強抗氧化能力,清除細胞
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