抗重組VP28囊膜蛋白單克隆抗體的制備及在對(duì)蝦白斑綜合征病毒檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征(WSS)是全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)所面臨的危害最大,傳播最廣的病害之一,至今已席卷了整個(gè)世界的對(duì)蝦養(yǎng)殖地區(qū),造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前尚無(wú)良好有效的防治手段,因此早期檢測(cè)和預(yù)防WSS成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。本研究主要克隆、表達(dá)了其病原對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28,并用純化的重組蛋白免疫小鼠制備了單克隆抗體(單抗),同時(shí)對(duì)制備的單抗在wssv檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了初步探索,研究結(jié)果將為對(duì)蝦自然感染W(wǎng)SSV狀況檢測(cè)和監(jiān)

2、測(cè)提供技術(shù)支撐,對(duì)了解病毒的感染與傳播,進(jìn)而控制該病毒的繼續(xù)蔓延有重要的意義,研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1)采用改良的差速離心法從人工感染W(wǎng)SS的克氏原螯蝦中分離純化了WSSV。完整的病毒外包被著囊膜,長(zhǎng)約300～400nm,直徑約100～120 nm。失去囊膜剩下的核衣殼呈螺旋圓柱體形,長(zhǎng)約300～450 nm,直徑約80～90 nm。純化的病毒形態(tài)和大小與先前報(bào)道的結(jié)果相似。2)以純化病毒基因組為模板,通過(guò)特定引物的設(shè)計(jì),利用PCR擴(kuò)增技

3、術(shù),克隆得到了完整的WSSV囊膜蛋白VP28基因,把該VP28基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)并用Ni-NTA柱純化后,分別用SDS-PAGE和Western Blot進(jìn)行蛋白鑒定。結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物均出現(xiàn)了與預(yù)測(cè)大小一致特異性條帶,表明VP28基因成功在大腸桿菌中進(jìn)行了有效表達(dá)。3)利用純化的重組VP28蛋白作為抗原免疫Balb/c小白鼠,將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,篩選獲得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,并克隆了能穩(wěn)定分泌強(qiáng)陽(yáng)性單克隆抗體的一株雜交瘤

4、細(xì)胞株anti-rVP28 MAb。通過(guò)ELISA和免疫電鏡對(duì)單抗的特異性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明所制得的單抗可以特異性地與WSSV上的VP28蛋白結(jié)合,說(shuō)明用重組VP28蛋白抗原刺激篩選得到的單抗能識(shí)別天然的VP28蛋白表位,可用于WSSV的檢測(cè)。4)通過(guò)Dot-blotting對(duì)WSSV進(jìn)行快速的檢測(cè)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)anti-rVP28 MAb能有效地檢測(cè)WSSV。競(jìng)爭(zhēng)性PCR結(jié)果表明anti-rVP28 MAb檢測(cè)WSSV的極限為病毒量10