針刺調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸穩(wěn)定的分子機(jī)制研究.pdf

1、作為神經(jīng)、內(nèi)分泌調(diào)控部位的下丘腦是對(duì)應(yīng)激信號(hào)和針刺信號(hào)發(fā)生反應(yīng)的重要部位。大量的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)應(yīng)激能夠嚴(yán)重影響人類的身心健康，誘發(fā)和加重疾病，其機(jī)制主要與下丘腦-垂體-腎上腺軸的活動(dòng)亢進(jìn)有關(guān)，而針刺對(duì)應(yīng)激誘發(fā)糖皮質(zhì)激素增高的下調(diào)作用也與其調(diào)節(jié)HPA軸有關(guān)。足三里穴是四大總穴之首，歷代針灸學(xué)家研究的最多。針刺足三里對(duì)機(jī)體能夠產(chǎn)生多種良性的雙向的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用是通過針刺信號(hào)激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)后而產(chǎn)生的一系列生物變化。然而，針刺足三里

2、是怎樣對(duì)HPA軸調(diào)節(jié)的、其調(diào)節(jié)的分子機(jī)制是什么并不清楚。 鑒于下丘腦是HPA軸活動(dòng)的最終共同通路，針刺信號(hào)和應(yīng)激信號(hào)均能夠引起下丘腦內(nèi)促腎上腺激素釋放激素(CRH)、精氨酸加壓素(AVP)等神經(jīng)肽類的改變。而CRH等基因的表達(dá)可以受到下丘腦室旁核內(nèi)c-fos、c-jun即刻基因表達(dá)的調(diào)控。c-fos的轉(zhuǎn)錄激活又與絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)有關(guān)，所以應(yīng)激過程中下丘腦p38MAPK的磷酸化程度以及c-fos蛋白的表達(dá)可能均會(huì)影響

3、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的活動(dòng)，參與針刺對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)作用。另一方面，海馬是調(diào)節(jié)HPA軸的高級(jí)中樞之一，海馬和下丘腦內(nèi)GC的濃度直接影響到HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，海馬和下丘腦局部GC的濃度受到神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素代謝酶11β-羥基類固醇脫氫酶1(11β-HSD1)的調(diào)節(jié)。所以，本試驗(yàn)針對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)過程中，以針刺足三里穴作為刺激信號(hào)，重點(diǎn)觀察了(1)針刺對(duì)下丘腦內(nèi)磷酸化p38MAPK的調(diào)節(jié)；(2)針刺對(duì)下丘腦內(nèi)c-fos蛋白表

4、達(dá)的調(diào)節(jié)；(3)針刺對(duì)海馬、下丘腦11β-HSD1的調(diào)節(jié)。通過這些研究旨在探討針刺調(diào)控HPA軸的分子機(jī)制，為針刺防治疾病提供更為有利的基礎(chǔ)機(jī)制，為進(jìn)一步研究開發(fā)防治應(yīng)激性損傷的藥物提供理論依據(jù)。 主要方法 1、采用激光共聚焦免疫熒光法，觀察了下丘腦內(nèi)p38MAPK與CRH的共存情況。 2、采用Western印跡雜交方法，觀察了①空白對(duì)照組、束縛應(yīng)激組、束縛應(yīng)激加針刺足三里穴組下丘腦磷酸化p38MAPK的變化；②以

5、上三組下丘腦內(nèi)標(biāo)志神經(jīng)元激活的c-fos蛋白表達(dá)的變化情況。③下丘腦、海馬內(nèi)11β-HSD1蛋白表達(dá)的變化。 3、采用放射免疫法，觀察了血漿內(nèi)皮質(zhì)酮的改變情況。 4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Wistar大鼠，購(gòu)于第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。 主要結(jié)果 1、針刺對(duì)束縛應(yīng)激大鼠血漿內(nèi)皮質(zhì)酮濃度的影響 束縛應(yīng)激結(jié)束后0、1h大鼠血漿內(nèi)皮質(zhì)酮濃度分別為49.1±9.3ng/ml、38.9±9.7ng/ml；與非應(yīng)激對(duì)照組

6、大鼠的(23.9±6.7ng/ml)相比，其差異具有顯著性意義(p＜0.05)。針刺結(jié)束后0、1h其血漿皮質(zhì)酮濃度分別為33.6±8.7ng/ml、27.5±7.8ng/ml，與應(yīng)激組相比，0h的差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.10，p＜0.10)，1h的相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、針刺對(duì)束縛應(yīng)激大鼠下丘腦磷酸化p38MAPK的影響 Western印跡雜交結(jié)果顯示束縛應(yīng)激后下丘腦內(nèi)磷酸化的p38MAPK明顯增加，與對(duì)照組相

7、比差別具有極顯著性意義(p＜0.01)，應(yīng)激解除后3h磷酸化的p38MAPK仍然保持較高的水平(p＜0.05)。針刺足三里穴并不導(dǎo)致下丘腦p38MAPK磷酸化的進(jìn)一步增加，而是對(duì)其磷酸化產(chǎn)生下調(diào)作用，針刺結(jié)束后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0h、1h、3h)下丘腦內(nèi)磷酸化p38MAPK均比束縛應(yīng)激組顯著下降(p＜0.05)。 3、下丘腦內(nèi)p38MAPK與CRH的共存情況 免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，大鼠束縛應(yīng)激后，下丘腦神經(jīng)元內(nèi)，不僅有染成紅

8、色的磷酸化p38MAPK免疫反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)，還有染成綠色的CRF免疫反應(yīng)物質(zhì)存在，而且磷酸化p38MAPK與CRF共存于同一個(gè)神經(jīng)元的胞漿內(nèi)。 4、針刺對(duì)束縛應(yīng)激大鼠下丘腦c-fos蛋白表達(dá)的影響 束縛應(yīng)激大鼠下丘腦內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)。束縛應(yīng)激大鼠經(jīng)針刺足三里穴后下丘腦內(nèi)c-fos蛋白與應(yīng)激組相比明顯回落，在針刺結(jié)束后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(Oh、1h、3h)下丘腦內(nèi)c-fos蛋白均比應(yīng)激組有所下

9、降，其差異均具有顯著性意義(p＜0.05)。 5、針刺對(duì)束縛應(yīng)激大鼠下丘腦、海馬11β-HSD1蛋白表達(dá)的影響 束縛應(yīng)激大鼠海馬內(nèi)11β-HSD1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)，下丘腦內(nèi)無明顯變化。束縛應(yīng)激大鼠經(jīng)針刺足三里穴后下丘腦內(nèi)11β-HSD1比應(yīng)激組有增加趨勢(shì)，在海馬內(nèi)11β-HSD1比應(yīng)激組進(jìn)一步增加，而且可以持續(xù)到針刺結(jié)束后1h(p＜0.05)。 結(jié)論 束縛應(yīng)激能夠引起大鼠血漿皮質(zhì)酮濃

10、度增加，針刺足三里穴可以下調(diào)應(yīng)激引起的血漿皮質(zhì)酮濃度的增加。針刺調(diào)節(jié)應(yīng)激后下丘腦-垂體-腎上腺軸活動(dòng)的分子機(jī)制一方面可能與其調(diào)節(jié)HPA軸的啟動(dòng)部位下丘腦內(nèi)p38MAPK磷酸化和c-fos蛋白的表達(dá)有關(guān)；另一方面也與調(diào)節(jié)HPA軸的負(fù)反饋部位內(nèi)下丘腦和海馬內(nèi)11β-HSD1蛋白的表達(dá)有關(guān)。盡管針刺對(duì)不同部位、不同物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用有所不同，但是其最終的調(diào)節(jié)功能和方向是一致的。 第一部分：應(yīng)激后大鼠下丘腦p38MAPK的變化及電針足三里穴

11、的調(diào)節(jié)作用 目的:觀察應(yīng)激對(duì)大鼠下丘腦p38MAPK的影響及電針足三里穴的調(diào)節(jié)作用。方法:將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、束縛應(yīng)激組、束縛應(yīng)激加針刺組，用Western印跡雜交法觀察三組大鼠下丘腦內(nèi)磷酸化p38MAPK的變化。結(jié)果:大鼠束縛應(yīng)激血漿皮質(zhì)酮增加，針刺后有所下降，束縛應(yīng)激時(shí)下丘腦內(nèi)p38MAPK磷酸化水平明顯高于對(duì)照組，且在束縛應(yīng)激解除后3小時(shí)仍保持較高水平，應(yīng)激大鼠經(jīng)針刺足三里穴后下丘腦內(nèi)磷酸化p38MAPK與應(yīng)激組相比明顯

12、回落，針刺的這種調(diào)節(jié)作用也可持續(xù)到針刺結(jié)束后3小時(shí)。結(jié)論:束縛應(yīng)激能夠引起下丘腦應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)p38MAPK磷酸化的增加，磷酸化的p38MAPK可能是應(yīng)激活動(dòng)過程中的重要事件之一。針刺足三里穴對(duì)下丘腦內(nèi)磷酸化p38MAPK的調(diào)節(jié)作用可能與調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸的活動(dòng)有關(guān)。 第二部分：電針對(duì)束縛應(yīng)激大鼠下丘腦神經(jīng)元活化的調(diào)節(jié)作用 目的:觀察應(yīng)激大鼠下丘腦神經(jīng)元的活化程度，以及電針足三里穴對(duì)它的調(diào)節(jié)作用。方法:將大鼠隨

13、機(jī)分為對(duì)照組、束縛應(yīng)激組、束縛應(yīng)激加針刺組，以標(biāo)志神經(jīng)元活化的c-fos蛋白作為檢測(cè)指標(biāo)，用Western印跡雜交法觀察三組大鼠下丘腦內(nèi)c-fos蛋白的變化。結(jié)果:束縛應(yīng)激大鼠下丘腦內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(p＜0.01=。束縛應(yīng)激大鼠經(jīng)針刺足三里穴后下丘腦內(nèi)c-fos蛋白與應(yīng)激組相比明顯回落，在針刺結(jié)束后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(Oh、1h、3h)下丘腦內(nèi)c-fos蛋白均比應(yīng)激組有所下降，其差異均具有顯著性意義(p＜0.05)。結(jié)論

14、:束縛應(yīng)激能夠引起下丘腦c-fos蛋白的表達(dá)增加，針刺足三里穴能夠下調(diào)下丘腦c-fos蛋白的表達(dá)水平，針刺可能在預(yù)防應(yīng)激性疾病中具有重要作用。 第三部分：針刺對(duì)應(yīng)激后大鼠下丘腦和海馬11β-羥基類固醇脫氫酶1的調(diào)節(jié) 目的:觀察應(yīng)激大鼠海馬、下丘腦11β-羥基類固醇脫氫酶1(11β-HSD1)的表達(dá)變化，以及電針足三里穴對(duì)它的調(diào)節(jié)作用。方法:將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、束縛應(yīng)激組、束縛應(yīng)激加針刺組，用Western印跡雜交法觀察