先天性遺傳性白內(nèi)障的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、先天性白內(nèi)障是兒童常見(jiàn)的致盲眼病，發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率為1．4／10,000萬(wàn)兒童，而在發(fā)展中國(guó)家，發(fā)病率較高，為5．15／10,000萬(wàn)兒童。全世界有13-20萬(wàn)雙側(cè)先天性白內(nèi)障患者致盲，并以2-4萬(wàn)／年遞增¨J。 遺傳因素在先天性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制上起了主要作用。迄今為止，至少發(fā)現(xiàn)了先天性單純性白內(nèi)障相關(guān)的12個(gè)位點(diǎn)和15個(gè)基因[2]。這些基因包括晶狀體蛋白(Q、β、Y晶狀體蛋白)、膜蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和功能尚不明確的蛋白

2、如Lim2等[3]。然而由于生命活動(dòng)真正的執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，基因水平無(wú)法涵蓋并解釋一切表型，隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)的發(fā)展，先天性白內(nèi)障的分子生物學(xué)研究也將進(jìn)入蛋白質(zhì)組階段。 由于動(dòng)物模型具有良好的可對(duì)比性，而且實(shí)驗(yàn)條件易于操控。本研究以先天性遺傳性白內(nèi)障小鼠為對(duì)象，觀察突變小鼠晶狀體組織形態(tài)學(xué)的變化；突變小鼠產(chǎn)生白內(nèi)障，在基因水平上證實(shí)是Crygs基因突變，而對(duì)基因突變引起的下游蛋白質(zhì)的變化未見(jiàn)報(bào)道。此種Crygs基因突變究竟是否引起γ

3、S晶狀體蛋白和／或其它蛋白質(zhì)的變化?本研究采用先進(jìn)的蛋白質(zhì)組技術(shù)手段，將突變與正常小鼠晶狀體總蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，從中尋找差異蛋白，闡明遺傳性白內(nèi)障的蛋白質(zhì)組變化，了解突變的Crygs基因?qū)铙w蛋白質(zhì)的影響。此外本研究通過(guò)收集先天性白內(nèi)障家系，發(fā)現(xiàn)先天性白內(nèi)障少見(jiàn)的遺傳方式——X性連鎖顯性遺傳；并以此家系中白內(nèi)障患者和健康對(duì)照者血清為研究對(duì)象，其目的希望能夠直接從血清中獲得診斷標(biāo)志物，最終提高白內(nèi)障的早期發(fā)現(xiàn)與早期診斷能力。 第一

4、部分：先天性遺傳性白內(nèi)障小鼠的晶狀體組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變 目的： 了解先天性Crygs基因突變小鼠晶狀體的組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變。 方法： 采用先天性Crygs基因自發(fā)突變小鼠動(dòng)物模型，遺傳方式為隱性遺傳。將5周齡的突變小鼠和正常小鼠分為兩組，擴(kuò)瞳后進(jìn)行眼部和生物裂隙燈顯微鏡照相。脊椎脫臼處死小鼠后摘除眼球，整個(gè)眼球固定并制作組織病理石蠟切片，HE染色后進(jìn)行光鏡觀察。取出小鼠晶狀體，戊二醛固定后分別行掃描電

5、鏡和透射電鏡標(biāo)本制作及檢查。 結(jié)果： 和正常小鼠相比，Crygs基因突變小鼠XY,H艮產(chǎn)生對(duì)稱的核性白內(nèi)障，晶狀體核區(qū)完全被白色混濁所覆蓋，而周邊皮質(zhì)透明。組織病理學(xué)上，突變小鼠的晶狀體可出現(xiàn)Morgagnian(馬氏)小體；前囊下皮質(zhì)纖維排列疏松，出現(xiàn)空泡樣改變；赤道部上皮細(xì)胞增殖明顯，并向前后極遷移；核心部嗜伊紅深染，纖維短縮，排列紊亂；后囊膜下出現(xiàn)空泡變性。透射電鏡顯示突變小鼠晶狀體細(xì)胞間隙增寬，胞漿中見(jiàn)較多腫脹線

6、粒體，胞漿顆粒粗大。掃描電鏡顯示突變小鼠的晶狀體皮質(zhì)和核性纖維排列腫脹且紊亂，球窩連接異常，并可出現(xiàn)馬氏小體和空泡樣變性。 結(jié)論： Crygs基因突變可導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞的增殖或變性，損害晶狀體細(xì)胞間的連接及纖維間的排列。γS晶狀體蛋白主要位于皮質(zhì)區(qū)，而其突變產(chǎn)生核性白內(nèi)障，提示核區(qū)可能是γS晶狀體蛋白繼發(fā)引起其它蛋白改變所致，需進(jìn)一步進(jìn)行晶狀體的蛋白質(zhì)分析。 第二部分：先天性遺傳性白內(nèi)障小鼠的晶狀體蛋白質(zhì)組分析

7、 目的： 比較研究先天性遺傳性白內(nèi)障的晶狀體總蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，探討基因突變小鼠的蛋白質(zhì)變化，并了解突變基因?qū)铙w蛋白質(zhì)的影響。 方法： 采用先天性遺傳性白內(nèi)障動(dòng)物模型，為自發(fā)的Crygs突變隱性遺傳小鼠。將5周齡的白內(nèi)障小鼠和正常小鼠分為兩組，提取晶狀體總蛋白，進(jìn)行固相pH梯度(IPG)等電聚焦雙向電泳，膠體考馬斯亮藍(lán)R-250染色，使用PDQuest7．30圖像分析軟件分析電泳圖像。選擇部分差異蛋

8、白點(diǎn)膠上酶解，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間／飛行時(shí)間(MALDI-TOF／TOF)儀器進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜(MS／MS)鑒定及分析。 結(jié)果： 不同的上樣量可以分離不同豐度晶狀體蛋白質(zhì)。高上樣量(如882μg)和12％分離膠能夠較好地分離低豐度蛋白，而高豐度蛋白點(diǎn)互相重疊。低上樣量(如190ug)時(shí)和12．5％濃度分離膠可很好地分離高豐度蛋白——晶狀體蛋白。對(duì)蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行重復(fù)性分析，各3次，將其中的一塊膠定為參考膠進(jìn)行3塊膠

9、間的蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配，上樣量為882gg時(shí)，白內(nèi)障組和正常組的平均匹配率分別為78．7％和813％；上樣量為190μg時(shí)，白內(nèi)障組和正常組的平均匹配率分別為90．4％和92．5％。上樣量為882ug時(shí)，白內(nèi)障和正常小鼠分別檢測(cè)到417±53個(gè)蛋白點(diǎn)(n=3)和370±4l蛋白點(diǎn)(n=3)。以正常圖譜為參考膠，正常組和白內(nèi)障組的平均匹配率分別為67％和53％。上樣量為190ug時(shí)，白內(nèi)障和正常小鼠分別檢測(cè)到60±7個(gè)蛋白點(diǎn)和57±5個(gè)蛋白點(diǎn)

10、(n=3)，以正常圖譜為參考膠，正常組和白內(nèi)障組的平均匹配率分別為93％和89％。不同膠間蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的位置偏差在IEF方向(橫向)平均為(0．92土O．15)mm，在SDS-PAGE方向(縱向)平均為(1．28士0．21)nllTl。選擇16個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，所有16種蛋白質(zhì)都得到了確切的鑒定，包括BFSP／filensin、γS、YF、βA1、βBl、BB2和QB等7種差異蛋白。突變小鼠晶狀體正常γS、念珠狀纖維結(jié)構(gòu)蛋白(BFSP

11、／filensin)缺失，YF表達(dá)下調(diào)(＜4倍)，異常BA1、βB1、βB2和QB表達(dá)上調(diào)(＞4倍)，分子量比正常小，提示βA1、βB1、BB2和QB可能發(fā)生裂解。 結(jié)論： 與正常晶狀體相比，先天性遺傳性白內(nèi)障有明顯的差異性蛋白表達(dá)譜?；虻耐蛔兛蓪?dǎo)致下游蛋白質(zhì)的變化，蛋白質(zhì)的雙向電泳和質(zhì)譜分析有助于下游蛋白的功能分析。對(duì)于研究YS晶狀體蛋白的功能，Crygs突變隱性遺傳小鼠是很好的動(dòng)物模型。Crygs基因突變導(dǎo)致YS晶

12、狀體蛋白的異常，并引起細(xì)胞骨架蛋白(BFSP／filensin)和其它晶狀體蛋白(YF、βA1、βB1、βB2和QB等)繼發(fā)改變，從而間接誘發(fā)白內(nèi)障。推測(cè)YS晶狀體蛋白可抑制內(nèi)源性水解酶的產(chǎn)生，從而抑制晶狀體蛋白的裂解。γS晶狀體蛋白可能和QB晶狀體蛋白一樣，不僅僅為結(jié)構(gòu)蛋白，還具重要的功能。 第三部分：先天性遺傳性白內(nèi)障一家系的血清蛋白質(zhì)組研究 目的： 比較研究先天性白內(nèi)障患者的血清總蛋白質(zhì)的變化及其意義。

13、 方法： 收集先天性遺傳性白內(nèi)障一家系，對(duì)家系成員進(jìn)行裂隙燈顯微鏡檢查，抽取靜脈血，收集正常者和患者的血清，采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，進(jìn)行固相pH梯度(IPG)等電聚焦雙向電泳，硝酸銀染色，ImageMaster圖像分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行分析。 結(jié)果： 患者裂隙燈檢查表現(xiàn)為雙眼對(duì)稱的繞核性白內(nèi)障，為胎兒核的周圍繞核混濁，而皮質(zhì)和胚胎核透明。臨床遺傳特點(diǎn)符合X性連鎖顯性遺傳。家系中年齡相近的正常者和白內(nèi)障患者的