AKT2在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf

1、基因突變所致的生長失調(diào)導致腫瘤細胞無限增生。同時，由于血供不足，腫瘤細胞通常處于一種缺氧和營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中。理論上，有兩種相互關(guān)聯(lián)又相互獨立的方法來應付氧供缺乏和營養(yǎng)不足的局面：一種是增加供應，這一觀點為大家廣為接受。另一種是忍受這種環(huán)境，勵行節(jié)約。腫瘤生長的需求往往超出其通過血管生成來改善自身的氧和營養(yǎng)的供應，這也許就是腫瘤生長過程中經(jīng)常伴隨著壞死灶形成的原因。只有在不利的微環(huán)境中仍能生存下去的細胞才能稱為惡性細胞。胰腺癌就是一種乏血

2、供的腫瘤，同時也是最具侵襲力的腫瘤之一。胰腺癌就診時多已發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，根治手術(shù)切除率低，治療效果不佳，對胰腺癌細胞生存和浸潤轉(zhuǎn)移機制的研究，可望找到解決這一問題的方法，提高胰腺癌臨床治療效果。 第一部分AKT2與HIF-1α在胰腺癌中的表達及其臨床意義 目的:探討胰腺癌組織中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(AKT2)、HIF-1α蛋白的表達及其臨床意義。 方法:應用免疫組化SABC法檢測63例胰腺癌組織和23例胰腺良性

3、病變組織中AKT2、HIF-1α蛋白的表達，分析其與胰腺癌臨床病理因素的關(guān)系。 結(jié)論:AKT2和HIF-1α在胰腺癌組織中表達增高，AKT2可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α表達來影響胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移。 第二部分:胰腺癌細胞在低氧低營養(yǎng)狀態(tài)下的生長特性及AKT2對HIF-1α的調(diào)節(jié)作用 目的:探討胰腺癌細胞在低氧低營養(yǎng)狀態(tài)下的生長特性及在此條件下AKT2對HIF-1α的調(diào)節(jié)作用，為胰腺腫瘤治療尋找有效靶點。

4、方法:在低氧低營養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)胰腺癌細胞株P(guān)ANC1和肝癌細胞株HepG2。用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法繪制胰腺癌細胞PANC1在低氧低營養(yǎng)狀態(tài)下的生長曲線。在用PI3K抑制劑LY294002處理胰腺癌細胞株P(guān)ANC1前后，用RT-PCR和免疫印記技術(shù)(WesternBlot)檢測細胞中AKT2、HIF-1α的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平的變化。 結(jié)論:在胰腺癌細胞中低氧低營養(yǎng)狀態(tài)可通過AKT2的激活調(diào)節(jié)HIF-1α的表達。

5、 第三部分:針對AKT2基因的短發(fā)夾狀RNA表達載體構(gòu)建及鑒定 目的:構(gòu)建及鑒定針對AKT2基因的短發(fā)夾狀RNA表達載體，研究shRNA對PANC1細胞中AKT2表達的影響，為探討RNA干擾作用及機制提供實驗資料。 方法:設計、合成針對AKT2基因的特異性shRNA模板序列，將其連接入含U6啟動子的pSIREN-DNR-DsRed-Express載體，得到針對AKT2shRNA表達載體pSIREN-DNR-DsRed-

6、Express-AKT2，并進行酶切和測序鑒定，然后在脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染PANC1細胞，檢測轉(zhuǎn)染效率。應用RT-PCR檢測其對AKT2基因表達的影響。 結(jié)論:本實驗已成功構(gòu)建針對AKT2基因的shRNA真核表達載體，通過其發(fā)揮RNAi作用在PANC1細胞中有效抑制了靶基因的表達，為下一步實驗奠定了基礎。 第四部分:AKT2短發(fā)夾狀RNA對胰腺癌細胞生物學行為的影響 目的:研究針對AKT2短發(fā)夾狀RNA對AKT2蛋白

7、的抑制作用，探討針對AKT2短發(fā)夾狀RNA對胰腺癌細胞PANC1增殖和凋亡的調(diào)控作用。 方法:應用免疫印記技術(shù)(WesternBlot)檢測轉(zhuǎn)染AKT2shRNA表達載體后胰腺癌細胞PANC1/pSIREN-DNR-DsRed-Express-AKT2(實驗組)、PANC1/pSIREN-DNR-DsRed-Express-NC(陰性對照組)和PANC1(空白對照組)的AKT2蛋白質(zhì)表達水平的變化；四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法