JMJD2A在人乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。根據(jù)GLOBOCAN測(cè)算，乳腺癌占所有癌癥病例的23％，并且構(gòu)成了癌癥死亡人數(shù)中的14％。因?yàn)槟[瘤進(jìn)展迅速和早期轉(zhuǎn)移，即使運(yùn)用多種手段治療，大多數(shù)晚期癌癥病人的預(yù)后都不理想。
　　JMJD2A屬于JMJD2蛋白家族，擁有JmjN，JnjC和2個(gè)串聯(lián)的PHD鋅指結(jié)構(gòu)、Tudor結(jié)構(gòu)域，分子量為130KD。JmjC結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是JMJD2家族發(fā)揮酶學(xué)功能的主要功能區(qū)，可以發(fā)揮去甲基化酶的催化功能，從而

2、打破組蛋白甲基化和去甲基化狀態(tài)的平衡。PHD鋅指結(jié)構(gòu)和Tudor結(jié)構(gòu)域則可能參與蛋白-蛋白相互作用，與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而導(dǎo)致染色質(zhì)重構(gòu)，其中染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物中尤以組蛋白去乙?；?Histone deacetylase，HDAC)最常見(jiàn)而最重要。
　　由于JMJD2A在人體廣泛表達(dá)，并且與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)尚未報(bào)道JMJD2A在人體乳腺癌組織中是否存在表達(dá)異常，JMJD2A的表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是否具有相

3、關(guān)性，如果存在相關(guān)性，JMJD2A通過(guò)何種途徑參與調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究擬從這三個(gè)方面入手，對(duì)JMJD2A參與人乳腺癌發(fā)生發(fā)展的功能及機(jī)制進(jìn)行研究。
　　第一部分 JMJD2A在人乳腺癌組織中表達(dá)及與ARHI，p53，ER，PR和CerbB-2相關(guān)性研究
　　目的:JMJD2A廣泛的表達(dá)于人體癌組織和細(xì)胞系中，但是尚未有文獻(xiàn)報(bào)道JMJD2A與乳腺癌的聯(lián)系。本部分研究致力于檢測(cè)JMJD2A在人乳腺癌中的表達(dá)情況，并且更進(jìn)

4、一步調(diào)查JMJD2A與ARHI，p53，ER，PR和CerbB-2腫瘤相關(guān)蛋白之間的關(guān)系。
　　方法:收集人乳腺癌樣本104例，纖維腺瘤樣本60例。使用HE染色組織學(xué)檢查驗(yàn)證樣本的醫(yī)院臨床病理診斷。分別使用免疫組化檢測(cè)，蛋白印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)乳腺癌組織和良性病變組織中JMJD2A的表達(dá)情況。使用免疫組化檢測(cè)和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)乳腺癌組織中ARHI，p53，ER，PR和CerbB-2的表達(dá)情況，并使用SPSS軟件軟件分析它們

5、與JMJD2A的相關(guān)性。
　　結(jié)果:樣本的臨床診斷都是準(zhǔn)確的。免疫組化結(jié)果顯示104例浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌組織樣本由22例強(qiáng)陽(yáng)性(21.2％)，34例陽(yáng)性(32.7％)，30例弱陽(yáng)性(28.8％)和18例陰性(16.7％)構(gòu)成。60例纖維腺瘤組織樣本免疫組化結(jié)果由2例強(qiáng)陽(yáng)性(33％)，5例陽(yáng)性(8.3％)，6例弱陽(yáng)性(10.0％)和47例陰性(78.3％)構(gòu)成。蛋白印記法顯示，浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌組織中JMJD2A蛋白的平均光密度為1.094±0

6、.151，纖維腺瘤組織中JMJD2A為0.563±0.105，浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌中JMJD2A蛋白的表達(dá)顯著高于纖維腺瘤組織。
　　結(jié)論:JMJD2A的表達(dá)被從原位，蛋白表達(dá)水平和信使RNA表達(dá)水平三個(gè)方面證實(shí)在人乳腺癌組織標(biāo)本中顯著高于在良性病變組織中。并且，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，在浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌組織中，JMJD2A與抑癌基因ARHI的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與p53和ER的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　第二部分 JMJD2A與高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞系M

7、DA-MB-231的相關(guān)性研究
　　目的:第一部分研究已經(jīng)證實(shí)JMJD2A在人乳腺癌組織標(biāo)本中的高表達(dá)，但是尚未能夠說(shuō)明其與乳腺癌的相關(guān)性，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。使用小干擾RNA來(lái)使靶基因沉默具有簡(jiǎn)單，特異性高和效率高的特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛使用。本部分實(shí)驗(yàn)運(yùn)用小干擾RNA沉默JMJD2A基因，觀察癌細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。
　　方法:用化學(xué)合成的JMJD2A特異性的小干擾RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 siRN

8、A組，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(使用轉(zhuǎn)染試劑和陰性對(duì)照siRNA)和空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基）。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染效率達(dá)到72.3％。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，siRNA組JMJD2A信使RNA相對(duì)表達(dá)量為0.386±0.108，空白組為0.998±0.170，陰性對(duì)照組為0.997±0.150。蛋白印跡法結(jié)果顯示，siRNA組JMJD2A蛋白的平均光密度為0.093±0.051，空白組中為0.203±0.042，陰性對(duì)照組中為0.210±0.

9、050。
　　結(jié)論:我們進(jìn)行的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染JMJD2A特異的小干擾RNA能夠下調(diào)JMJD2A信使RNA表達(dá)水平致其沉默，能夠抑制JMJD2A蛋白的表達(dá)。在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染JMJD2A特異的小干擾RNA實(shí)驗(yàn)手段是成功的。進(jìn)而能夠?qū)е录?xì)胞周期改變和增殖抑制，以及能夠抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力。本部分研究證明了在人乳腺癌組織中，沉默JMJD2A基因能夠抑制

10、癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，JMJD2A在人乳腺癌的高表達(dá)不是一種偶然，而是與癌細(xì)胞生物學(xué)行為具有相關(guān)性的。
　　第三部分 JMJD2A與低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的相關(guān)性研究
　　目的:前兩部分的研究已經(jīng)證實(shí)JMJD2A在人乳腺癌組織標(biāo)本高表達(dá)，證明JMJD2A與癌細(xì)胞生物學(xué)行為具有相關(guān)性。在高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染JMJD2A特異的小干擾RNA能夠下調(diào)JMJD2A信使RNA表達(dá)水平致其沉默，能夠抑

11、制JMJD2A蛋白的表達(dá)，進(jìn)而能夠?qū)е录?xì)胞周期改變和增殖抑制，以及能夠抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力。轉(zhuǎn)染是有效的。但是僅僅只證明JMJD2A與高侵襲性的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系的相關(guān)性是有瑕疵的，無(wú)法代表各種類(lèi)型的乳腺癌細(xì)胞，因此仍需對(duì)其他的乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以完整JMJD2A與乳腺癌相關(guān)性的研究。低侵襲性的MCF-7細(xì)胞系與高侵襲性的MDA-MB-231細(xì)胞系能夠模仿乳腺癌在體內(nèi)的表達(dá)模式，因此選用MCF-7細(xì)胞系能夠有效的對(duì)第

12、二部分進(jìn)行補(bǔ)充。
　　方法:在這部分研究中，我們改為使用低轉(zhuǎn)移性的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系。用化學(xué)合成的JMJD2A特異性的小干擾RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7siRNA組，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(使用轉(zhuǎn)染試劑和陰性對(duì)照siRNA)和空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基）。使用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡法檢測(cè)三組細(xì)胞JMJD2A在信使RNA和蛋白水平的表達(dá)。使用流式細(xì)胞術(shù)和WST-8檢測(cè)法檢測(cè)三組細(xì)胞細(xì)胞周期和增殖能力。使用Transwell小

13、室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70.4％。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，siRNA組JMJD2A信使RNA相對(duì)表達(dá)量為0.55±0.03，空白組為0.98±0.02，陰性對(duì)照組為0.94±0.03。蛋白印跡法結(jié)果顯示，siRNA組JMJD2A蛋白的平均光密度為0.083±0.031，空白組中為0.223±0.053，陰性對(duì)照組中為0.208±0.047。
　　結(jié)論:我們進(jìn)行的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明

14、在低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中轉(zhuǎn)染JMJD2A特異的小干擾RNA也能夠下調(diào)JMJD2A信使RNA表達(dá)水平致其沉默，能夠抑制JMJD2A蛋白的表達(dá)，進(jìn)而能夠?qū)е录?xì)胞周期改變和增殖抑制，以及能夠抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力。在第一部分和第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，證明了對(duì)無(wú)論高侵襲性還是低侵襲性的乳腺癌細(xì)胞系，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染JMJD2A特異的小干擾RNA都能使JMJD2A沉默，都能夠有效的抑制其增殖、遷移和侵襲的惡性生物學(xué)行為。JMJD2A與人乳腺

15、癌的發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性是一種共性。
　　第四部分 JMJD2A參與抑癌基因ARHI調(diào)控機(jī)制的研究
　　目的:前三部分實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明，JMJD2A在人乳腺癌中高表達(dá)，JMJD2A與人乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。第一部分發(fā)現(xiàn)JMJD2A與ARHI表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。抑癌基因ARHI在人乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)被抑制的狀態(tài)。JMJD2A能夠與HDAC1、HDAC3和pRb等蛋白相互作用。研究表明E2Fs與ARHI表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，HD

16、ACs也被表明參與ARHI的表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)。我們推測(cè)ARHI可能是JMJD2A的調(diào)節(jié)靶基因，JMJD2A能夠調(diào)控ARHI的表達(dá)。但是調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。
　　方法:本部分實(shí)驗(yàn)對(duì)成對(duì)的乳腺癌組織和癌旁非腫瘤組織中JMJD2A和ARHI進(jìn)行蛋白印跡法測(cè)定。對(duì)乳腺癌組織和非乳腺癌組織的連續(xù)切片進(jìn)行JMJD2A和ARHI免疫組化染色。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染JMJD2A特異性siRNA后JMJD2A和ARHI在mRNA和蛋

17、白水平的表達(dá)。使用免疫共沉淀方法確定JMJD2A結(jié)合的蛋白。通過(guò)染色質(zhì)共沉淀方法確定JMJD2A是否與ARHI啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。
　　結(jié)果:蛋白印跡分析實(shí)驗(yàn)顯示，JMJD2A高表達(dá)的人乳腺癌組織樣本中ARHI呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，對(duì)應(yīng)的癌旁的非人乳腺癌組織樣本中JMJD2A的表達(dá)低于人乳腺癌組織樣本，同時(shí)ARHI的表達(dá)也高于人乳腺癌組織樣本中。
　　結(jié)論:我們驗(yàn)證了JMJD2A與ARHI表達(dá)的負(fù)相關(guān)性，在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-