微囊化細胞的制備凍存及微囊化胚胎干細胞的培養(yǎng).pdf

1、微囊化細胞技術(shù)已被廣泛應用在細胞培養(yǎng)、免疫隔離等方面的研究.APA微囊以其生物相容性好的特點而得到研究人員的重視.但APA微囊的制作方面也存在一些問題.胚胎干細胞是解決細胞來源不足的主要方法,它在今后細胞治療方面具有重要的意義,但目前胚胎干細胞定向分化過程中存在擬胚體獲得率低的問題.另外微囊化細胞的運輸凍存也是急需解決的問題.因此該文從以下三個部分對這也問題進行了研究.第一部分 APA微囊的制備及檢測.目的:優(yōu)化高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器制

2、備微囊的條件.方法:利用該實驗室設計制作的高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器制作微囊,測定了微囊的直徑分布,比較了聚賴氨酸(PLL)處理不同時間及檸檬酸鈉液化與否對微囊穩(wěn)定性的影響.在此基礎上檢測了微囊的組織相容性和細胞生物相容性.結(jié)果:高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器制作的膠珠直徑范圍為100-750 μ m;APA微囊具有長期穩(wěn)定性,聚賴氨酸處理6min,并且不用檸檬酸鈉處理其穩(wěn)定性最好,體外150天后微囊的正常率為73.0%.移植入體內(nèi)5周后,回收率達

3、80%.細胞在微囊內(nèi)可以正常生長.結(jié)論:應用高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器可以制作大小均勻一致,穩(wěn)定性、生物相容性良好的微囊.第二部分 微囊化細胞的凍存研究.目的觀察不同類型微囊凍存細胞的效果,為微囊凍存選擇合適的冷凍保護劑.方法:1.應用該實驗室制作的高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器制作液化的海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊和海藻酸鈉-鈣膠珠包被HK-2細胞.2用DMSO和甘油作為冷凍保護劑冷凍未包被的HK-2細胞、APA微囊包被的HK-2

4、細胞、膠珠包被的HK-2細胞.3解凍后用MTT法(四噻唑藍)測定細胞活性、考馬斯蘭法測定蛋白質(zhì)含量、Hochest33258熒光染料測定DNA含量.結(jié)果解凍后液化微囊內(nèi)HK-2細胞的細胞活性、蛋白質(zhì)含量、DNA含量均顯著高于膠珠內(nèi)細胞(P<0.05),但與未包被組差異不顯著(P>0.05).DMSO作為冷凍保護劑,細胞活性、蛋白質(zhì)含量均高于甘油組(P<0.05),但二者在DNA含量上無差異(P>0.05).液化微囊與DMSO合用細胞活性

5、、蛋白質(zhì)含量、DNA含量均高于液化微囊與甘油合用(P<0.05).液化微囊解凍后穩(wěn)定性優(yōu)于膠珠.結(jié)論液化微囊冷凍保存效果優(yōu)于膠珠,DMSO適于微囊冷凍.第三部分 微囊化胚胎干細胞的培養(yǎng).目的:觀察胚胎干細胞在微囊中分化形成擬胚體的可行性.方法:應用自制的高壓脈沖靜電液滴發(fā)生器制作的直徑為100-750 μ m的APA微囊包被綠色熒光蛋白標記的小鼠胚胎干細胞,觀察微囊中胚胎干細胞方法分化為擬胚體,釋放擬胚體,貼壁培養(yǎng),觀察擬陪體的分化.結(jié)