大麗輪枝菌V07DF2 T-DNA插入突變體庫的構建及表型變異突變體的篩選.pdf

1、大麗輪枝菌（VerticilliumdahliaeKleb.）是一種引起棉花、茄子等多種作物黃萎病的土傳病原真菌。目前，對該病菌致病的分子機理研究還不夠深入，病原菌與作物之閻的相互識別機制也仍然不夠明了，對該病的防治也未有顯著的成效。本研究旨在為深入解析大麗輪枝菌的分子致病機理奠定基礎。
　　以江蘇省棉花黃萎病菌的代表菌株強致病力落葉型菌株V07DF2和中等致病力非落葉型菌株Bp2為對象，建立了農桿菌介導的轉化方法（Agrobac

2、teriumtumefaciens-mediatedtransformation，ATMT），對這兩株大麗輪枝菌，進行了綠色熒光蛋白的標記。將經(jīng)改造而成的熒光標記載體1300-HYG-sGFP，通過ATMT方法將其T區(qū)整合入大麗輪枝菌基因組中，并且通過對ATMT法的修改，使最終轉化效率達到0.1％～0.2％，即106個孢子可轉化長出1000～2000個轉化子。通過對轉化子進行篩選，獲得熒光表達較強并性狀穩(wěn)定的轉基因菌株，然后接種擬南芥，

3、觀察其侵染過程。結果表明，被熒光標記的菌株在細胞、組織層面上均可以很好的反應不同侵染階段的特征。熒光標記大麗輪枝菌的研究為建立穩(wěn)定的大麗輪枝菌遺傳轉化體系奠定了基礎，同時也為深入探尋該病原菌侵染和致病機理積累了研究材料。
　　由于T-DNA插入突變是隨機的，其中包含了大量的無意突變。啟動子捕獲技術（promotertrap）是在T-DNA區(qū)域的邊界附近構建一個無啟動子的報告基因（如GFP），該元件和選擇標記基因一起組成捕獲載體。T

4、區(qū)兩側的報告基因只要插入到受啟動子啟動的區(qū)域或與未知基因發(fā)生正確的融合表達，該報告基因就被激活，從而可以避免無意義的插入突變。我們在已經(jīng)建立的ATMT方法基礎上，構建雙向GFP啟動子捕獲載體，將其轉入大麗輪枝菌V07DF2中，構建V07DF2T-DNA插入突變體庫，共保存了6000個突變體。雙向啟動子捕獲載體T-DNA區(qū)兩端分別含有GFP的ORF和終止子，中間有潮霉素抗性盒子和質粒拯救元件。沒有啟動子的GFP序列可以捕獲表達基因的啟動子

5、，潮霉素抗性盒子用于篩選轉化子，而質粒拯救元件有利于獲得T-DNA插入位點的序列片段。隨機選擇突變體，進行分子實驗分析，判斷載體各片段的功能，以保證雙向啟動子捕獲載體的有效性。T-DNA插入突變體庫中突變體在保存前都需經(jīng)過單孢分離，以防止交叉污染，同時保證每個突變體T-DNA的穩(wěn)定整合。
　　在大麗輪枝菌V07DF2T-DNA插入突變體庫中，隨機選擇1000個突變體進行表型分析，篩選指標為菌落生長速度、菌絲形態(tài)、產色素情況、產孢能