CDK2AP1,SMARCE1及PGCs在雞胚性腺發(fā)育中的作用研究.pdf

1、雞胚性腺是重要的動(dòng)物器官發(fā)生研究模型，雞的性別決定基因還沒有確定，性腺分化相關(guān)基因的研究還不深入，高效利用雞胚性腺模型及建立實(shí)用的性反轉(zhuǎn)技術(shù)需要加強(qiáng)對(duì)性腺分化相關(guān)基因的研究。白消安處理雞胚是獲得嵌合體雞受體雞胚的有效方法，然而不同劑量白消安對(duì)雞胚成活率的影響及對(duì)原始生殖細(xì)胞的敲除效率還有待深入研究。本研究圍繞性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和白消安處理雞胚的工作，引入并優(yōu)化整體原位雜交技術(shù)，利用整體原位雜交并結(jié)合半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫組

2、化技術(shù)檢測(cè)雞胚性腺分化相關(guān)基因Cdk2ap1在組織水平的時(shí)空表達(dá)；合成雞胚性腺分化相關(guān)基因Smarcel的RNA探針，比較超表達(dá)后該基因的表達(dá)變化及睪丸和卵巢組織形態(tài)的變化；研究白消安對(duì)雞在胚胎期成活率、原始生殖細(xì)胞數(shù)目及對(duì)睪丸和卵巢組織形態(tài)的影響。具體研究內(nèi)容及結(jié)論如下：
　　 在雞胚研究中引入整體原位雜交技術(shù)，研究雞Cdk2ap1基因的表達(dá)，先設(shè)計(jì)Cdk2ap1引物并通過半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Cdk2ap1基因片段，

3、構(gòu)建Cdk2ap1/pGEM-T重組質(zhì)粒。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，使用Sp6和T7 RNA聚合酶合成地高辛標(biāo)記的正、反義RNA探針，通過控制蛋白酶K消化的濃度、探針雜交的濃度，以及雜交后的洗滌溫度，得到了低本底、著色清晰的雜交結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)室建立了雞胚整體原位雜交方法。為探討Cdk2ap1基因在雞胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)，借助建立的胚胎整體原位雜交技術(shù)研究了Cdk2ap1在4.0 d雌雄雞胚中的表達(dá)。結(jié)果表明Cdk2ap1基因在4.0 d兩

4、性胚胎的腦間質(zhì)、菱腦、聽囊、脊神經(jīng)管、前肢等部位均有表達(dá)，且在雄性雞胚中的表達(dá)量高于雌性。在雄性雞胚的生殖脊、后肢部位中該基因有表達(dá)但在雌性胚胎對(duì)應(yīng)部位卻基本沒有表達(dá)。利用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、整體原位雜交和免疫組織化學(xué)染色法研究6.5-10.5 d雞胚性腺中Cdk2ap1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因隨著胚胎的發(fā)育表達(dá)下調(diào)，在雌性性腺中的表達(dá)高于雄性性腺中的表達(dá)。鑒于該基因在雌雄雞胚中的差異表達(dá)，推測(cè)Cdk2ap1基因在雞胚性腺發(fā)育及性

5、別分化過程中起一定調(diào)節(jié)作用。
　　 為了研究Smarcel在鳥類性別決定和分化中的潛在作用，用RCASBP.B逆轉(zhuǎn)錄病毒載體超表達(dá)處理雞胚，整體原位雜交和免疫組化研究表明該基因在感染雞胚中上調(diào)表達(dá)。利用HE染色觀察12.5 d雌雄性腺組織形態(tài)，結(jié)果表明重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的雞胚卵巢皮質(zhì)比對(duì)照組厚、雞胚睪丸中的曲細(xì)精管索和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組。鑒于該基因?qū)ΣG丸和卵巢組織形態(tài)的增生作用，推測(cè)SMARCE1能同時(shí)促進(jìn)雌雄性腺的發(fā)育。

6、r>　　 使用不同劑量白消安(0μg，120μg，240μg，360μg and480μ9)處理雞胚后，統(tǒng)計(jì)不同日齡雞胚的成活率，并利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)雞胚原始生殖細(xì)胞表面抗原SSEA-1的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析雞胚性腺中原始生殖細(xì)胞數(shù)目的變化。采用HE染色觀察白消安處理雞胚后8.5 d、11.5 d和14.5 d睪丸和卵巢的組織形態(tài)變化。結(jié)果表明低劑量(<120μg)的白消安處理對(duì)雞胚成活率沒有明顯影響(P>0.05)，而中劑量(240

7、μg and360μg)的白消安處理顯著降低雞胚成活率(P<0.05)，高劑量(480μg)的白消安處理進(jìn)一步降低雞胚的成活率(P<0.05)。睪丸和卵巢對(duì)白消安處理的反應(yīng)不同，在睪丸中存在原始生殖細(xì)胞數(shù)目的自調(diào)節(jié)，而卵巢中的原始生殖細(xì)胞對(duì)白消安幾乎沒有反應(yīng)。低劑量白消安對(duì)雞胚性腺組織形態(tài)沒有影響，睪丸曲細(xì)精管索數(shù)目沒有變化，卵巢皮質(zhì)厚度正常，髓質(zhì)內(nèi)細(xì)胞排列和細(xì)胞數(shù)目正常。隨著白消安劑量的增加，雞胚性腺形態(tài)開始發(fā)生異常。高劑量白消安處理