豬瘟病毒E2基因RT-PCR檢測(cè)方法的建立及病毒分子流行病學(xué)研究.pdf

1、豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由豬瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起豬的高度致死性、接觸性傳染病。本研究建立了CSFV E2 RT—PCR檢測(cè)方法，并采用該方法進(jìn)行了CSFV在人工感染實(shí)驗(yàn)豬體內(nèi)的組織分布研究，同時(shí)對(duì)我國(guó)部分地區(qū)進(jìn)行了CSFV分子流行病學(xué)研究。 為了建立一種準(zhǔn)確靈敏特異的CSFV RT—PCR檢測(cè)方法，并根據(jù)目的產(chǎn)物的序列進(jìn)行C

2、SFV的分子流行病學(xué)研究，分析CSFV的分子遺傳進(jìn)化趨勢(shì)。本研究通過(guò)比對(duì)GenBank公布的34條國(guó)內(nèi)外已測(cè)得的CSFV全長(zhǎng)序列、18條牛病毒性腹瀉病病毒—Ⅰ(BVDV—Ⅰ)和6條BVDV—Ⅱ基因組全序列，避開(kāi)與BVDV同源區(qū)域，在CSFV基因組E2區(qū)域設(shè)計(jì)并合成了4對(duì)引物，標(biāo)記為F1—R1、F2-R1、F3—R1、F4—R2；以CSFV石門(mén)株血毒為標(biāo)準(zhǔn)模板對(duì)引物進(jìn)行篩選，然斤對(duì)RT—PCR反應(yīng)體系各成分進(jìn)行優(yōu)化，建立了一套CSFV R

3、T—PCR檢測(cè)方法。采用研制的三批CSFV RT—PCR試劑，通過(guò)對(duì)30個(gè)質(zhì)控樣品進(jìn)行特異性、靈敏度、敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性驗(yàn)證后，證明該反應(yīng)體系對(duì)FMDV/C220、PPV09/79、PRRSV/BJ、BVDV—OregonC24、BVDV—NADL、PRV—BJ/99、PCV-2/71等7種其他病原不能檢出；靈敏度可達(dá)到8.9pg/uL病毒RNA；重復(fù)檢出率分別在91.11％-100％；同時(shí)采用歐盟豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室20份標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行符

4、合性試驗(yàn)，符合率達(dá)到90％，表現(xiàn)出高度的一致性。結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性、靈敏度、敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。 為了全面系統(tǒng)的研究豬瘟病毒感染后在豬體內(nèi)外的病毒分布規(guī)律，指導(dǎo)流行病學(xué)調(diào)查采樣，本研究通過(guò)肌肉注射人工感染毒價(jià)為4×103.84TCID50/ml的CSFV石門(mén)株血毒，造成16頭60日齡長(zhǎng)白豬急性感染模型，同時(shí)設(shè)立1頭陰性對(duì)照。人工感染后每天隨機(jī)選擇兩頭豬，腋動(dòng)脈放血致死，采集各組織器官和體外排泄分泌物共34種，采用

5、上述建立的CSFV RT—PCR檢測(cè)方法對(duì)34種急性樣品進(jìn)行CSFV核酸檢測(cè)，并用抗CSFV E2單抗WH303對(duì)其中22種組織器官進(jìn)行免疫組化檢測(cè)抗原；同時(shí)進(jìn)行臨床觀察、體溫測(cè)定并給予進(jìn)行臨床計(jì)分。RT—PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，感染后第一天有7種組織器官CSFV檢測(cè)為陽(yáng)性，至第五天34種急性樣品全部檢測(cè)為陽(yáng)性，整個(gè)感染病程中血液的CSFV核酸檢出數(shù)最多，檢出率93.7％(15/16)：其次是各種與免疫相關(guān)的淋巴結(jié)和淋巴樣組織，而肌肉和皮膚

6、檢出數(shù)最少；4種體外樣品(糞、尿、眼分泌物、鼻拭子)分別在3-5天內(nèi)檢出陽(yáng)性。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，22種組織器官切片中有19種觀察到陽(yáng)性信號(hào)，這19個(gè)組織器官與CSFV RT—PCR檢測(cè)結(jié)果相符合；而皮膚、肌肉和喉頭的組織切片中未觀察到陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果表明在CSFV人工急性感染模型中，病毒感染后能在24小時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)病毒血癥，持續(xù)整個(gè)急性感染病程；病毒對(duì)血液和與免疫相關(guān)的組織器官表現(xiàn)出更高的親和性，并且在3-5天內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)體外排毒；CSF

7、V RT—PCR和免疫組化兩種方法在急性感染模型的檢測(cè)中具有較高的符合性，符合率為86.36％。上述研究對(duì)CSFV臨床診斷具有重要的指導(dǎo)意義，臨床急性感染豬應(yīng)首先采集血液和免疫器官，其次為空腸、回腸段等組織器官。但是在對(duì)感染豬只進(jìn)行處理時(shí)必須嚴(yán)格控制對(duì)感染豬胴體的處理，以防止疾病擴(kuò)散。 運(yùn)用本研究所建立的CSFV RT—PCR對(duì)我國(guó)18省市644份疑似豬瘟樣品進(jìn)行檢測(cè)，再將檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品序列進(jìn)行分析，以研究國(guó)內(nèi)豬瘟流行態(tài)勢(shì)和地

8、理分布。結(jié)果644份疑似樣品中檢出CSFV陽(yáng)性74份，測(cè)回序列73條：經(jīng)過(guò)DNAStar分析，發(fā)現(xiàn)73株流行株分別為基因1.1(50.68％)、2.1(42.47％)、2.2(5.48％)等3個(gè)亞群，與HCLV核苷酸同源性在75.7％-100％之間與SM核苷酸同源性在74.3％-100％之間，流行株推導(dǎo)氨基酸序列與HCLV和SM株氨基酸序列同源性均在85.5％-100％之間；73株野毒以“北京、天津、河北——湖北——廣東”軸東西發(fā)散式分