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文檔簡介
1、本論文在成功建立了法氏囊組織雙向凝膠電泳(Two dimensional gel electrophoresis,2-DE)技術(shù)基礎(chǔ)上,分別對MDV超強毒株RB1B感染的SPF雞在不同階段法氏囊組織中病毒感染水平和宿主差異蛋白質(zhì)組進行研究,對其中的部分差異點進行了質(zhì)譜鑒定和回復驗證。并對差異蛋白進行生物信息學分析,探討了MDV感染引起法氏囊差異蛋白變化的意義和可能機制。 1.雞法氏囊蛋白質(zhì)組學雙向電泳方法的建立 以SPF
2、雞的法氏囊組織為研究對象,用固相pH梯度膠條進行等電聚焦,SDS-PAGE垂直電泳,采用不同的樣品制備方法,對上樣量、水化、等電聚焦、膠條平衡和凝膠染色方法等進行一系列優(yōu)化,并應用PDQuest8.0.1軟件對圖譜進行初步分析。結(jié)果顯示法氏囊組織在pH5-8范圍17 cm的2-DE膠上可以得到很好的分離,膠體考染后經(jīng)PDQuest軟件分析正常法氏囊組織可檢測到800個以上蛋白點,不同2-DE圖譜間蛋白點平均匹配率為83.5%。本研究建立
3、了雞法氏囊組織蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù),為法氏囊發(fā)育進化及其免疫功能的研究提供了可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。 2.馬立克氏病病毒感染后法氏囊組織中病毒感染水平研究 MDV在體內(nèi)的感染分為四個主要階段:早期溶細胞感染,潛伏感染,再次溶細胞感染,腫瘤細胞增生。本研究用超強毒株RB1B感染SPF雞,感染后的不同階段(4DPI、7DPI、14DPI和21DPI)對法氏囊等組織進行了感染狀態(tài)研究,組織冰凍切片,HE染色觀察,結(jié)果顯示在感染
4、后期法氏囊和胸腺明顯萎縮,脾臟明顯腫大,切片觀察法氏囊組織濾泡嚴重萎縮,濾泡內(nèi)淋巴細胞排列松散,濾泡間質(zhì)增寬,肌細胞層彌漫性增生。同時利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測不同階段法氏囊中MDV的gB和Meq基因的mRNA相對表達水平。結(jié)果顯示MDV-Meq基因的mRNA水平在7DPI、21DPI時明顯增高,21DPI時達到差異極顯著;MDV-gB基因在4DPI和21DPI時顯著性增高,而在潛伏期7DPI和14DPI時則明顯下降,這些數(shù)據(jù)顯示M
5、DV在感染雞法氏囊中復制正常,也為后期的病毒感染宿主差異蛋白質(zhì)組學研究提供了條件。 3.馬立克氏病病毒感染后法氏囊組織的蛋白質(zhì)組學研究 采用2-DE技術(shù),對RB1B感染的SPF雞和對照組雞的法氏囊在不同感染階段(4DPI、7DPI、14DPI和21DPI)的組織樣品進行了蛋白質(zhì)組分離,利用PDQuest8.0.1軟件對2-DE圖譜進行分析,對其中的部分差異點進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果平均每塊膠能檢測到800-900個蛋白點,四個
6、階段共有77個差異蛋白點,利用統(tǒng)計分析方法篩選出差異極顯著且變化有規(guī)律的蛋白點29個,其中表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)的有13個,持續(xù)下調(diào)的有10個,先期上調(diào)后期下調(diào)的2個,先期下調(diào)后期上調(diào)的4個。對這些蛋白點進行切膠消化,用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassociated laser dissociation/ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)進行鑒定分
7、析。共鑒定出24個蛋白,它們是載脂蛋白AI(ApoAI)、白血病相關(guān)蛋白18(LAP18)、癌蛋白18(Op18)、Ras相關(guān)蛋白Rab11A、兩種熱休克蛋白27(HSP27)、BUB同系蛋白、含硫氧還蛋白域5(TXNDC5)、伴侶素蛋白(CCT)、β2-微球蛋白(BMG)、熱休克蛋白40(HSP40)、磷酸甘露糖變位酶蛋白、慢骨骼肌肌鈣蛋白T、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶A3前體、dUTP焦磷酸酶蛋白、D樣不均一核核糖核蛋白、醛縮酶C蛋白、胰
8、蛋白、LOC129607類似蛋白、含錯配修復酶假定蛋白、含GTPase假定蛋白、兩種含GATase1樣結(jié)構(gòu)域假定蛋白。另外,還發(fā)現(xiàn)了兩個數(shù)據(jù)庫中沒有的禽源蛋白,這有待于更進一步的研究。通過數(shù)據(jù)庫查詢和生物信息學分析,證實這些已知的差異蛋白與新陳代謝相關(guān)的占19%,與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的占15%,與細胞增殖和調(diào)亡相關(guān)的占15%,與信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的占22%,與免疫相關(guān)的占15%,與細胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白的占7%,其它占7%。在此基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)有的文獻
9、報道,對這些差異蛋白質(zhì)的功能、與病毒感染發(fā)病關(guān)系以及腫瘤相關(guān)方面進行分析討論。提出ApoAI持續(xù)的過量表達可能與MDV病毒粒子跨膜感染機制有關(guān),同時以ApoAI過表達為主導的脂類代謝紊亂可能是最終導致MDV感染易引起動脈粥樣硬化的主要原因;LAP18和Op18的波動性調(diào)節(jié)可能與MDV引起的腫瘤形成早期有關(guān);RB1B誘導的HSP27蛋白過量表達可能有利于其子代病毒大量產(chǎn)生:持續(xù)上調(diào)表達的Rab11A蛋白可能與MDV細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,囊泡出芽,逃
10、避免疫或復制機制有關(guān),Rab11A也有望成為抗單純皰疹病毒分子治療的作用靶點;BMG的下調(diào)表達可能與MDV引起的免疫抑制有關(guān):與腫瘤形成有關(guān)的BUB3同系物蛋白和TXNDC5蛋白在RB1B感染后的四個階段均表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)表達,后期差異極顯著可能預示著MDV感染的腫瘤形成。本研究首次報道了在MDV感染下的宿主法氏囊組織中一些重要蛋白的差異變化,為更深入研究MDV致病機制和病毒性致腫瘤機制提供了可靠數(shù)據(jù),同時也為把MDV感染雞作為腫瘤模型動
11、物奠定了基礎(chǔ)。 4.感染MDV后法氏囊中ApoA1、Op18的mRNA變化和ApoAI蛋白變化研究 通過對RB1B感染雞不同階段的法氏囊組織中的差異蛋白的檢測,發(fā)現(xiàn)ApolipoproteinA1(ApoAI)呈現(xiàn)持續(xù)性過量表達,而Oncoprotein18(Op18)的蛋白表達水平呈現(xiàn)波動性交化。本研究通過半定量RT-PCR的方法,對RB1B感染后不同時間點的實驗組與對照組法氏囊組織中ApoAI和Op18的mRNA水平
12、進行檢測,比較2-DE和質(zhì)譜結(jié)果的一致性;同時,將完整的ApoAI和Op18開放閱讀框分別克隆進入pGEX6p1載體,通過誘導表達手段分別獲得了這兩個帶有GST的融合蛋白,將融合蛋白GST-ApoAI通過電洗脫的方法回收后免疫Balb/c小鼠制備多抗血清,再利用多抗血清采用Western blot檢測手段對2-DE和質(zhì)譜結(jié)果進行蛋白表達水平上的驗證。結(jié)果顯示不同階段ApoAI和Op18的mRNA水平變化與2-DE和質(zhì)譜分析的結(jié)果基本一致
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