歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的原核表達(dá)與單克隆抗體的研制.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）于1987年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，臨床主要表現(xiàn)為懷孕母豬的繁殖障礙和新生仔豬的呼吸道疾病。病原PRRSV屬尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PRRSV基因組大小約為15kb，含有9個(gè)開放閱讀框（ORFs），其中ORF7編碼的核衣殼蛋白（N蛋白）作為病毒粒子中含量最高、免疫原性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白之一，對(duì)

2、于PRRS的診斷及監(jiān)控防治具有重要意義。本研究選取歐洲型PRRSV SS-6毒株為研究對(duì)象，在克隆并鑒定該病毒N蛋白基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)行N蛋白的原核表達(dá)，并利用表達(dá)的重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體，為建立有效的歐洲型PRRSV檢測(cè)方法以及N蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1.歐洲型PRRSV N蛋白基因的克隆及原核表達(dá)
　　 根據(jù)GenBank中歐洲型PRRSV標(biāo)準(zhǔn)毒株（LV）ORF7基因序列設(shè)計(jì)了3條引物，且在其中兩

3、條引物上分別設(shè)計(jì)了EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，以此引物擴(kuò)增PRRSV SS-6毒株的N蛋白基因。將獲得的PCR產(chǎn)物用EcoR I和Xho I酶切后與經(jīng)同樣處理的pGEX-6p-1原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)胞后挑取陽(yáng)性克隆。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證后，將重組質(zhì)粒pGEX-N轉(zhuǎn)化至E.coli BL-21中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，重組質(zhì)粒在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，重組N蛋白分子量大小約為40kDa。

4、免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，以融合表達(dá)的重組N蛋白免疫小鼠制備的抗血清能夠與超速離心純化的歐洲型PRRSV發(fā)生特異性反應(yīng)，證明所表達(dá)的蛋白具有PRRSV抗原性。
　　 2.歐洲型PRRSV N蛋白單克隆抗體的制備
　　 取純化的重組GST-N蛋白免疫6～8周齡Balb/c小鼠，分離其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆，并采用有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過(guò)3次亞克隆獲得1株能穩(wěn)定分泌抗N蛋白抗